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    乳酰-N-新四糖的生理功能、生物合成及其衍生化研究進展

    2022-04-12 03:29:42孟佳煒朱鶯鶯羅國聰張文立沐萬孟
    中國食品學(xué)報 2022年3期
    關(guān)鍵詞:巖藻唾液酸基轉(zhuǎn)移酶

    孟佳煒,朱鶯鶯,羅國聰,萬 李,張文立,沐萬孟,2*

    (1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)食品安全國際聯(lián)合實驗室 江蘇無錫 214122)

    母乳以配方奶粉和牛乳不可替代的營養(yǎng)價值而被視為嬰幼兒的最佳食物。母乳與其它乳制品最重要的差別就在于所含寡糖的種類和含量不同,在母乳中所含有的母乳寡糖 (human milk oligosaccharides,HMOs) 在非人類乳汁中的含量及復(fù)雜性均大大下降。研究表明,HMOs 不僅能提供嬰幼兒生長所需的基本營養(yǎng),而且具有維持腸道菌群的生態(tài)平衡的益生性[1]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[2]、抵抗病原體侵染[3]以及促進新生兒大腦早期發(fā)育[4]的功能。其中,2'-巖藻糖乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL) 和乳酰-N-新四糖 (lacto-N-neotetraose,LNnT)均被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐洲食品安全局(EFSA)批準作為營養(yǎng)強化劑添加到嬰幼兒食品中[4]。

    HMOs 的核心結(jié)構(gòu)約有20 種,由核心結(jié)構(gòu)經(jīng)過巖藻糖基化和唾液酸化,構(gòu)成豐富多樣的HMOs[5]。其中,LNnT 是HMOs 重要的核心結(jié)構(gòu),也是最簡單的type 2 型糖,由半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和葡萄糖(Glc)組成,結(jié)構(gòu)為Gal β1-4 GlcNAc β1-3 Gal β1-4 Glc (見圖1)。此外,LNnT 還可以通過巖藻糖基化和唾液酸化產(chǎn)生多種衍生物(見圖1),包括乳酰-N-巖藻糖五糖(lacto-N-fucopentaose,LNFP)、乳酰-N-新巖藻糖五糖 (lacto-N-neofucopentaose,LNnFP)、乳酰-N-新二巖藻糖六糖 (lacto-N-neodifucohexaose,LNnDFH)和唾液酸乳酰-N-四糖(ialyllacto-N-tetraose,LST)。

    圖1 乳酰-N-新四糖及其主要衍生物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of LNnT and its main derivatives

    LNnT 的合成方法主要有化學(xué)合成和生物合成。常規(guī)化學(xué)合成方法步驟冗雜,副產(chǎn)物多,產(chǎn)物收率低,而生物合成因底物可再生性、反應(yīng)特異性和環(huán)境友好性的優(yōu)勢而被視為體外合成LNnT 及其它HMOs 的最具前景的方法。

    1 生理功能

    1.1 益生元功能

    HMOs 在口腔及小腸中難以消化,由此得以進入腸道中被其中的有益菌群所利用,從而具有益生元功能[4]。在37 ℃厭氧條件下補充含有LNnT的混合低聚糖培養(yǎng)嬰兒腸道中的雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis),結(jié)果表明其確實能夠促進雙歧桿菌的生長和代謝活動[6]。隨后對無菌小鼠的飼喂試驗發(fā)現(xiàn),與不添加LNnT 的對照組相比,添加LNnT 的試驗組的腸道菌群中的雙歧桿菌無論是數(shù)量還是種群豐度都有了顯著提升,證實了LNnT 對促進腸道內(nèi)的雙歧桿菌的生長具有獨特的優(yōu)勢[7]。而后通過給6 個嬰兒補充含有LNnT 的HMOs 混合物,發(fā)現(xiàn)他們在3 個月大時,益生菌的定殖率增加,而病原菌定殖率下降,由此證實LNnT 在嬰兒體內(nèi)確實具有益生效應(yīng)[1]。

    1.2 免疫調(diào)節(jié)功能

    目前已有大量研究報道LNnT 及其衍生物可通過增加Gr1+細胞和抗原提呈細胞(antigenic presenting cells,APC) 的數(shù)量來激發(fā)2 型免疫。Terrazas 等[8]揭示了LNnT-葡聚糖能有效地促進小鼠的抑制性細胞及未成熟的骨髓細胞的增殖,從而誘導(dǎo)T 細胞增殖分化產(chǎn)生IL-13、IL-4 和IL-10及限制INF-的產(chǎn)生,最終激發(fā)2 型免疫。以樹突狀細胞為代表的APCs,因具有多種糖類抗原受體也能夠激活Th2 免疫。LNFP III 被發(fā)現(xiàn)可通過與曼氏血吸蟲(Schitosoma mansoni)蟲卵抗原的特異性結(jié)合誘發(fā)Th2 免疫[9],也可激活小鼠骨髓來源的樹突狀細胞而誘發(fā)Th2 免疫[2]。

    1.3 抗病原體及毒素功能

    由于HMOs 與靶細胞表面的受體具有相似的糖鏈結(jié)構(gòu),因此既可與受體直接結(jié)合,又可以偽裝成受體直接與病原體及毒素結(jié)合,從而阻遏其與靶細胞的結(jié)合[10]。體外實驗證實了LNnT 及其唾液酸化衍生物能夠阻斷肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)與腸上皮細胞的黏附從而抑制肺炎鏈球菌性肺炎的發(fā)生。動物模型試驗發(fā)現(xiàn)LNnT 和LSTc 能減少在肺炎鏈球菌肺部的定植并持續(xù)抑制其黏附[11],且在補充LNnT 后的30 min 內(nèi),肺炎鏈球菌的黏附率就會降低[12]。

    1.4 調(diào)節(jié)腸道細胞增殖分化

    2008年來,Kuntz 等[13-14]發(fā)現(xiàn)了從母乳中分離出的寡糖可以調(diào)節(jié)腸道細胞的增殖和分化。Holscher 等[15]通過對LNnT、2'-FL 和6'-唾液酸乳糖(6'-sialylactose,6'-SL) 的體外研究發(fā)現(xiàn)這3種主要的HMOs 均可抑制細胞增殖,但抑制增殖所需的閾值劑量隨著HMOs 的種類和細胞類型的不同而改變。

    2 生物合成

    化學(xué)法合成LNnT 需要引入保護基團[16],步驟繁冗,且存在保護不到位、后續(xù)脫除不徹底及發(fā)生其它副反應(yīng)的問題,而且常需要使用有毒有害試劑。相比之下,生物法合成由于酶與底物的特異性高、合成步驟簡化和副產(chǎn)物少,更適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),成為了LNnT 及其它HMOs 的極具前景的綠色合成方式。

    2.1 酶法合成

    乳酰-N-三糖II(lacto-N-triose II,LNT II)是合成LNnT 的常見前體??上群铣蒐NT II,再通過將半乳糖以β-1,4 鍵連接至受體底物上,實現(xiàn)由LNT II 到LNnT 的轉(zhuǎn)化(見圖2)。

    圖2 酶法合成乳酰-N-三糖II 及向乳酰-N-新四糖的酶法轉(zhuǎn)化Fig.2 Enzymatic synthesis of LNT II and its further conversion to LNnT

    2.1.1 酶法合成LNT II 哺乳動物來源的β-1,3-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(β-1,3-GnT)(EC 2.4.1.149) 能夠催化來源于尿苷-5'-二磷酸-GlcNAc(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)轉(zhuǎn)移至N-乙酰乳糖胺衍生物末端的3'-OH 位置形成N-乙酰乳糖胺聚糖鏈[17]。當(dāng)以乳糖為受體,UDP-GlcNAc 的GlcNAc 為供體時,即可合成LNT II。1983年Yates 等[18]首次報道了使用人血清中的β-1,3-GnT 作為催化劑,合成了微摩爾規(guī)模的LNT II。Murata 等[19]使用牛血清提取的β-1,3-GnT 和商業(yè)化的UDP-GlcNAc 進一步優(yōu)化了合成步驟,合成了毫摩爾規(guī)模的LNT II。

    腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)來源的β-1,3-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(LgtA)具有廣泛的受體譜,而且以乳糖為受體時比活力是哺乳動物來源的β-1,3-GnT 的75 倍以上[20]。在添加LgtA 的化學(xué)酶法[21]和一鍋多酶(OPME)[5]系統(tǒng)中合成了LNT II。其中OPME 系統(tǒng)以GlcNAc 和乳糖為底物,得到了1.5 g 的LNT II[5]。而利用來源于幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori) 的LgtA 催化GlcNAc 和乳糖生成了高達88%產(chǎn)率的LNnT[22]。

    在酶的挖掘過程中發(fā)現(xiàn),在β-N-乙酰己糖胺酶的13 個候選物中,11 種具有轉(zhuǎn)糖基化活性,其中來源于兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)的β-N-乙?;禾前访?(BbhI)(EC 3.2.1.52)的催化活性最高。后續(xù)試驗還進一步發(fā)現(xiàn)了以硝基苯N-乙?;?β-D-葡萄糖胺 (pNP-β-GlcNAc 或pNP-NAG)為供體,乳糖為受體時LNT II 的合成效率最高,達到了44.9%[23]。Schm?lzer 等[24]還成功構(gòu)建了BbhI 的突變體D746E,其轉(zhuǎn)糖基化的選擇性相對于產(chǎn)物水解的選擇性高出了13 倍,選擇另一種有效供體N-乙酰基-D-氨基葡萄糖1,2-惡唑啉(N-acetyl-D-glucosamine 1,2-oxazoline,NAG-oxa) 與乳糖反應(yīng)僅1 h 就得達到了約為90%的產(chǎn)率,表明該突變體具有的應(yīng)用潛力。將該糖合酶固定于瓊脂糖珠填充的固定床中形成了LNT II 的連續(xù)合成方法,LNT II 的生產(chǎn)率為80~100 mmol/(L·min-1)[25]。還有其它細菌來源的β-N-乙?;禾前访冈贚NT II 的生產(chǎn)中也具有應(yīng)用潛力,如從土壤樣品中篩選出的兩種酶分別以GlcNAc2 和乳糖為底物時產(chǎn)率分別為2%和8%[26],以及從Tyzzerella nexilis 中鑒定出的一種新型酶以pNP-β-GlcNAc 和乳糖為底物時產(chǎn)率為57.2%[27]。

    2.1.2 酶法轉(zhuǎn)化LNT II 生成LNnT 一些β-半乳糖苷酶可以催化半乳糖基從乳糖轉(zhuǎn)移至LNT II從而合成LNnT。來源于圓環(huán)芽孢桿菌(Bacillus circulans) 的β-半乳糖苷酶就可以催化得到基于LNT II 為19%的產(chǎn)率[19]。來源于圓環(huán)芽孢桿菌ATCC 31382 的BgaD-D,來源于嗜熱棲熱菌HB27(Thermus thermos-philes)的Ttβ-gly 和來源于激烈熱球菌DSM 3638(Pyrococcus furiosus)的CelB 合成LNnT 的產(chǎn)率基于乳糖分別為7.1%,5.2%和1.0%,基于LNT II 分別為1.4%,1.0%和0.2%[28],而且提高底物濃度可使BgaD-D 的催化活性進一步提高,基于乳糖的產(chǎn)率為17.3%[27]。

    商業(yè)化的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.22)[21]和來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtB)[22]已成功用于以UDP-半乳糖和LNT II 為底物合成LNnT,其中純化后的LgtB催化產(chǎn)率高達93%。

    2.2 代謝工程合成

    與酶法合成相似,LNnT 的代謝工程合成也需要先合成LNT II,而LgtA 作為代謝通路中的關(guān)鍵酶,負責(zé)催化外源添加的乳糖和內(nèi)源合成的UDPGlcNAc 反應(yīng)生成LNT II?;贚NT II 生物合成途徑的構(gòu)建,將LgtB 引入到工程菌株中,催化LNT II 的半乳糖基化,產(chǎn)生LNnT(見圖3)。

    圖3 乳酰-N-三糖II 及乳酰-N-新四糖在大腸桿菌內(nèi)的生物合成途徑Fig.3 Biosynthesis pathway of LNT II and LNnT in E.coli

    乳糖轉(zhuǎn)運酶(LacY) 能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)運到細胞中,β-半乳糖苷酶(LacZ)的缺失抑制了乳糖水解,大腸桿菌JM109 是LacZ 缺失且含有LacY (lacY+lacZ-)的菌株,當(dāng)將腦膜炎奈瑟氏球菌的lgtA 基因以質(zhì)粒為載體導(dǎo)入其中時,通過分批補料可高效生產(chǎn)LNT II,產(chǎn)量為6 g/L。當(dāng)來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的LgtB 與LgtA 共表達時,LNT II 進一步轉(zhuǎn)化為LNnT 和副產(chǎn)物乳酰新六糖 (lacto-neohexaose,LNnH),得到高達5 g/L 的總產(chǎn)量[29]。

    Baumg?rtner 等[30]通過對腦膜炎奈瑟氏球菌來源的lgtA 進行染色體整合,構(gòu)建了無質(zhì)粒的工程化lacY+lacZ-大腸桿菌菌株來合成LNT II。之后以葡萄糖為主要碳源合成了1.906 g/L 的LNT II,以甘油為主要碳源合成了2.465 g/L 的LNT II,結(jié)果表明甘油作為碳源優(yōu)于葡萄糖。之后進一步試驗發(fā)現(xiàn)以半乳糖作為唯一碳源的分批補料培養(yǎng)得到了12.72 g/L 的LNT II[31]。

    目前已在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了UDP-半乳糖和UDP-GlcNAc 的兩個前體供應(yīng)的代謝通路,實現(xiàn)了合成LNnT 的關(guān)鍵前體的供應(yīng)平衡。在枯草芽孢桿菌中共表達LacY、LgtA 和LgtB 高效地合成了LNnT,通過分批補料培養(yǎng)得到了4.52 g/L的LNnT 和2.64 g/L 的LNT II[32]。又利用成簇的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列干擾(CRISPRi)的策略下調(diào)了涉及競爭途徑的基因,微調(diào)了LNT II 和LNnT 的代謝通路,最終分批補料培養(yǎng)得到了5.41 g/L 的LNnT 和2.98 g/L 的LNT II[33]。

    3 衍生化

    HMOs 被劃分為非巖藻糖基化的中性HMOs、巖藻糖基化HMOs 及唾液酸化HMOs。其中巖藻糖基化HMOs 約占所有HMOs 的35%~50%,唾液酸化約占總量的12%~14%,且其各種HMOs 的生理活性得到了廣泛的研究驗證。LNnT 利用α-L-巖藻糖苷酶(EC3.2.1.-)或α-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1-)催化巖藻糖殘基以α1,2 和α1,3 鍵連接到半乳糖、葡萄糖或GlcNAc 殘基上得到巖藻糖基化的衍生物,主要有LNnFP I,LNnFP II(LNFP III),LNnFP V(LNFP VI)和LNnDFH II。LNnT 利用唾液酸糖苷酶(EC 3.2.1.18)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶(SiaT,EC 2.4.99-) 催化唾液酸殘基以α2,3 和α2,6 鍵連接到半乳糖殘基上構(gòu)成唾液酸化的寡糖,主要有LSTa 和α-2,6-二唾液酸-N-新四糖(DSLNnT)。

    3.1 巖藻糖基化

    α-L-巖藻糖苷酶(EC3.2.1.-)主要作用是催化α-L-巖藻糖苷的水解,但同時也顯示出了催化巖藻糖基轉(zhuǎn)移到低聚糖的糖合酶活性。來源于B.bifidum 的L-1,3/4-L-巖藻糖苷酶(EC 3.2.1.111)(BbAfcB) 能夠以LNnT 為受體合成LNFP III,來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen) 的酶(CpAfc2)具有相同的催化能力且合成的LNFP III產(chǎn)率更高[34]。來源于嬰兒長雙歧桿菌亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis) 的α-L-巖藻糖苷酶(BiAfcB)也被改造為α-1,3/4-L-轉(zhuǎn)巖藻糖苷酶用于LNFP III 合成[35]。一項專利報道了Bi-AfcB 的高效突變體,以LNnT 和3-FL 為底物,催化合成LNFP III 的活性提高了7 300 倍[36]。

    巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1-)可以催化L-巖藻糖基從鳥苷二磷酸(GDP)-巖藻糖轉(zhuǎn)移至受體。來自幽門螺桿菌的α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Hp3FT) 在以GDP-巖藻糖為供體,LNnT 為受體時能夠生成LNFP III 并進一步巖藻糖基化為LNnDFH II[22,37]。來源于幽門螺桿菌UA948 的α-1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(HP3/4FT)能從巖藻糖和其它受體出發(fā)產(chǎn)生LNFP III、LNDFH II 和LNnDFH II[38]。幽門螺桿菌DSM6709 來源的FucT III 對LNnT 表現(xiàn)出高效特異性,在合成LNFP VI 后可進一步巖藻糖基化為LNnDFH II[39]。脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis) 來源的Bf13FT能夠催化GDP-巖藻糖將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到乳糖和N-乙酰乳糖胺(LacNAc)上,生成LNnFP II(LNFP III)、LNnFP V 和LNnDFH II[40]。

    在構(gòu)建了LNnT 生物合成代謝工程菌的基礎(chǔ)上,進一步引入編碼特定巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因可在體內(nèi)實現(xiàn)LNnT 的巖藻糖基化。通過向已構(gòu)建GDP-巖藻糖從頭合成代謝途徑的工程菌中引入fucT、futA 和futB 這3 個H.pylori 26695 來源的α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因,合成了多種巖藻糖基化的LNnT 衍生物[41-42]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),futT 的導(dǎo)入得到了3 g/L 的LNnFP V,同時產(chǎn)生了少量的LNnDFH II[41]。futA 的導(dǎo)入得到了1.7 g/L LNnFP V,futB 的導(dǎo)入得到了LNnFP V、LNnFP II 和LNnDFH II[42]。通過增加GDP-巖藻糖途徑并表達FutC 同樣實現(xiàn)了LNnT 的工程菌體內(nèi)的巖藻糖基化,提純后得到了3 g 低聚糖,其中LNnFP I 的含量為57%[43]。

    3.2 唾液酸化

    唾液酸糖苷酶主要作用是催化去除末端唾液酸基殘基的反應(yīng),部分唾液酸糖苷酶對特定的供體和受體底物也表現(xiàn)出一定的轉(zhuǎn)唾液酸的活性[44],例如在轉(zhuǎn)唾液酸糖苷酶的催化作用下,成功地以LNnT 和N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)為底物合成了衍生物L(fēng)STd[45]。

    唾液酸轉(zhuǎn)移酶(SiaTs) 催化唾液酸從供體胞苷-5'-單磷酸 (CMP)-N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)轉(zhuǎn)移至各種受體上。McArthur 等[46]通過誘變篩選得到具有α-2,6-SiaT 催化活性的P34H/M144L突變體,可以同時產(chǎn)生LSTc βProN3 和DSLNnT βProN3。有專利報道構(gòu)建了萊氏發(fā)光菌(Photobacterium leiognathi)α-2,6-SiaT 的多位點變異體,提高了其生產(chǎn)LSTc 的轉(zhuǎn)移酶活性、區(qū)域選擇性和熱穩(wěn)定性,用該高效突變體催化LNnT 合成LSTc 的最大轉(zhuǎn)化率可達55%左右[36]。某些SiaTs還能催化合成LNnT 雙唾液酸化衍生物,如淡色光細菌(Photobacterium damselae)來源的α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Pd2,6ST 可以催化NeuAc 和LNnT合成達到了克規(guī)模的DSLNnT[47-48]。

    4 結(jié)語

    食品工業(yè)的任務(wù)隨著社會的發(fā)展而變化,如今人們對食品的需求已轉(zhuǎn)變?yōu)楦咂焚|(zhì)的營養(yǎng)健康,為了更好地模擬母乳,完善嬰幼兒配方奶粉的功能供給,母乳寡糖的相關(guān)研究目前處于火熱階段。由于一鍋多酶體系和代謝工程的發(fā)展,LNnT及其它HMOs 的生物合成雖然已取得了重大進展,但依然處于低產(chǎn)率、低效價及低生產(chǎn)率的階段,遠不足以支撐規(guī)?;墓I(yè)生產(chǎn)。

    UDP-半乳糖、UDP-GlcNAc、GDP-巖藻糖和CMP-NeuAc 等核苷酸糖的合成被認為是代謝途徑中的限速步驟,需要進一步地研究以提高這些核苷酸糖的再生。此外,寡糖合成過程的部分中間產(chǎn)物對細胞生長具有影響,可以通過對代謝途徑的動態(tài)調(diào)節(jié)等手段來平衡細胞生長HMOs 生產(chǎn)。目前酶法合成LNnT 及其衍生物的研究較多,尤其是包含關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶和前體生成酶的一鍋多酶反應(yīng),該方法在實現(xiàn)HMOs 的高產(chǎn)中具有巨大潛力,但關(guān)鍵酶在工程菌內(nèi)的可溶性表達和催化效率問題亟待解決,還需挖掘新的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶。定向挖掘得到的酶可通過理性設(shè)計、半理性設(shè)計或定向進化策略提高其轉(zhuǎn)糖基化效率和熱穩(wěn)定性,以實現(xiàn)HMOs 的高效生產(chǎn)。

    綜上所述,兩種生物合成方法都具有其獨特的優(yōu)勢,酶法合成復(fù)雜的HMOs 可能更具潛力,但簡單HMOs 的合成代謝工程優(yōu)勢更顯著。而隨著近年來對LNnT 及其衍生物的生理功能的揭示,HMOs 的需求量將會迅速增長。

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