磷酸鹽對(duì)面筋蛋白特性的影響

劉瑞莉，陸啟玉，王法林，吳曉寅，谷艷平

（1 中央儲(chǔ)備糧漯河直屬庫(kù)有限公司 河南漯河462000 2 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州450000）

面條起源于我國(guó)，至今已有4 千多年的制作食用史，經(jīng)過多年的發(fā)展，不僅在全國(guó)各地形成了許多頗具地方特色的面條，還開發(fā)了方便面、生鮮面、冷凍熟面等新的面條品種[1]。目前面條的加工已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，然而，由于我國(guó)通用小麥粉蛋白質(zhì)含量偏低，面筋質(zhì)量較差，使面條產(chǎn)品的斷條率較高，面條不耐煮，易糊湯，口感較差，因此，在面條加工過程中，科學(xué)合理地使用食品添加劑是改善面條的加工性能和食用品質(zhì)的主要途徑之一[2-3]。

磷酸鹽能改善或賦予食品某些優(yōu)異的性能，是面條中常用的改良劑[4]。面條加工過程中常用的磷酸鹽是復(fù)合磷酸鹽，是多種磷酸鹽的混合物，由于其組成成分的種類甚多，因此，往往根據(jù)其用途來調(diào)節(jié)添加比例?；谖覈?guó)傳統(tǒng)面條的特點(diǎn)，通常選用六偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉和磷酸二氫鈉4 種進(jìn)行復(fù)合來調(diào)節(jié)面條品質(zhì)[5]。大量研究表明，不同復(fù)配比例的復(fù)合磷酸鹽，對(duì)面條品質(zhì)改善的效果各有不同，表明每種磷酸鹽的作用機(jī)理各有不同[6-7]。雖然磷酸鹽已在面條加工中廣泛使用，但是磷酸鹽對(duì)面條品質(zhì)的影響機(jī)理目前尚不明確，對(duì)其合理、安全使用缺乏科學(xué)指導(dǎo)。本試驗(yàn)選用最常用的焦磷酸鈉（TSPP）、三聚磷酸鈉（STPP）和六偏磷酸鈉（SMP）3 種磷酸鹽，研究磷酸鹽單一種類、不同比例添加方式對(duì)面筋蛋白特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉，鄭州金苑特一粉；石油醚，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備

MARS60 哈克旋轉(zhuǎn)流變儀，德國(guó)HAAKE 公司；Saxspace 小角X-散射儀，奧地利anton paar 公司；7504 紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司制造；IRPrestige-21 傅里葉變換光譜儀，日本島京公司；LGJ-10 冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；DT5-4B 離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FW-200 高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JJSY30×8 圓型驗(yàn)粉篩，上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 面筋蛋白的制備及其基本成分測(cè)定

1）面筋蛋白的制備 采用索氏抽提法，用石油醚進(jìn)行脫脂處理，經(jīng)手洗將面筋蛋白與淀粉分離，置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，粉碎、研磨，過108 目篩，備用。

2）測(cè)定面筋蛋白基本成分 水分的測(cè)定采用GB/T5009.3-2010《直接干燥法》；粗蛋白含量的測(cè)定采用GB/T5009.5-2010《凱氏定氮法》；粗脂肪含量的測(cè)定采用GB/T14772-2008《索氏抽提法》；灰分的測(cè)定采用GB/T5009.4-2010《馬弗爐法》。

1.3.2 添加磷酸鹽的面筋蛋白流變學(xué)特性的測(cè)定面筋蛋白流變學(xué)特性的測(cè)定參照琚亞麗等[8]的方法并略有改動(dòng)。稱取2.0 g 樣品于小燒杯中，加磷酸鹽溶液（0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%）2.0 mL，用玻璃棒攪拌使樣品粘連成較為規(guī)整的球狀，小心取出樣品，輕放于流變儀兩平行板之間，進(jìn)行流變學(xué)性能的測(cè)定。設(shè)定兩平行板間隙1 mm，測(cè)量溫度25 ℃，以一定速度緩慢勻速使上板調(diào)至預(yù)設(shè)的測(cè)量位置，輕輕刮掉周圍擠壓出的多余樣品，然后對(duì)樣品進(jìn)行應(yīng)力掃描和頻率掃描。

1.3.3 面筋蛋白溶液的制備 磷酸鹽處理面筋蛋白方法：稱取4.0 g 面筋蛋白于燒杯中，將磷酸鹽按比例（0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%）溶解到適量蒸餾水中，用玻璃棒攪拌使其與面筋蛋白混合均勻，然后用保鮮膜封住燒杯口，室溫放置半小時(shí)，使面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，粉碎、過篩（108 目），封裝備用。

取0.5 g 上述面筋蛋白樣品，分別溶解于50 mL 0.5 mol/L 乙酸溶液中，置搖床搖動(dòng)24 h。將溶解的樣品超聲處理15 s 后用冷凍離心機(jī)，以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速，5 ℃離心30 min。采用A280nm紫外光吸收法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量，配制5 mg/mL 的面筋蛋白溶液。有研究表明，稀乙酸溶液是面筋蛋白的良好溶劑，可忽略溶劑的影響，即乙酸溶液不會(huì)對(duì)面筋蛋白分子鏈產(chǎn)生影響[9]。

1.3.4 面筋蛋白的小角X-散射（SAXS）試驗(yàn) 測(cè)定面筋蛋白分子質(zhì)量參照文獻(xiàn)[9]方法并略有改動(dòng)。將1.3.3 節(jié)中制得的樣品置于透明玻璃毛細(xì)管狀的樣品器中，將樣品器置于樣品槽中，在光源X射線散射站進(jìn)行測(cè)定。

參數(shù)設(shè)定：溫度設(shè)定26 ℃，樣品器到成像板的距離261.2 nm，測(cè)定時(shí)間45 min。

當(dāng)光源照射在樣品上，通過二維成像板探測(cè)器測(cè)量散射光強(qiáng)度隨散射角度的變化，得到樣品的X-小角散射（SAXS）空間分布譜。

1.3.5 面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 采用傅里葉紅外光譜法，對(duì)面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。將溴化鉀放在培養(yǎng)皿中，40 ℃恒溫干燥6 h，備用。稱取2.0 mg 1.3.3 節(jié)制備的不同磷酸鹽處理的面筋蛋白樣品，加入200～400 g 溴化鉀，將面筋蛋白樣品和溴化鉀在瑪瑙研缽中混合，研磨均勻，用紅外專用的壓片機(jī)壓片，使壓力60 kPa 下保持1 min，取下樣品壓片（呈均勻、透明狀），放入樣品室，在400～4 000 cm-1波段進(jìn)行傅里葉紅外光譜（FTIR）掃描，掃描32 次，分辨率為4[10-11]。

1.3.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 將每個(gè)待測(cè)樣品均設(shè)3 次重復(fù)，采用SPSS 16.0 軟件方差分析，采用Duncan方法多重比較，顯著水平P＜0.05。采用WPS 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 面筋蛋白基本成分

面筋蛋白基本成分如表1所示，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定提取的面筋蛋白中蛋白含量為85.08%，淀粉、灰分及脂肪含量較低，符合試驗(yàn)的基本要求。

2.2 流變學(xué)特性

振幅掃描：設(shè)定溫度25 ℃，頻率1 Hz，對(duì)樣品進(jìn)行振幅掃描，以確定樣品線性黏彈性區(qū)域，如圖1所示。當(dāng)形變量大于1%時(shí)，樣品進(jìn)入非線性黏彈性區(qū)域。為確保試驗(yàn)過程中樣品面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不被破壞，設(shè)置形變量為0.8%。

表1 面筋蛋白的基本成分Table 1 Basic components of wheat gluten

圖1 面筋蛋白應(yīng)力掃描圖Fig.1 Stress scan of gluten

頻率掃描：在25 ℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行小振幅震蕩測(cè)試（即頻率掃描），采用的頻率范圍0.1～10 Hz，應(yīng)變振幅設(shè)置為0.8%，此時(shí)應(yīng)力為50 Pa。該值在所測(cè)樣品的線性黏彈性區(qū)域，測(cè)得的儲(chǔ)能模量（G'）、損耗模量（G"）分別表征對(duì)應(yīng)樣品的彈性和黏性，結(jié)果如圖2 至圖4所示。

由圖2a 可看出，當(dāng)焦磷酸鈉添加量較低時(shí)，降低了面筋蛋白的儲(chǔ)能模量；當(dāng)添加量超過0.4%時(shí)，顯著提高了面筋蛋白的儲(chǔ)能模量；當(dāng)焦磷酸鈉添加量為0.8%時(shí)，面筋蛋白的儲(chǔ)能模量最高。由圖2b 可知，隨著焦磷酸鈉添加量的增加，面筋蛋白的損耗模量有所增加，當(dāng)焦磷酸鈉添加量為0.8%時(shí)，損耗模量達(dá)最大值。添加焦磷酸鈉后，損耗角正切值均有所增大。

從圖3a 來看，三聚磷酸鈉的添加量過低或過高，均降低面筋蛋白儲(chǔ)能模量。當(dāng)添加量分別為0.4%，0.6%時(shí)，面筋蛋白的儲(chǔ)能模量有所提高。從圖3b 可知，面筋蛋白的損耗模量與三聚磷酸鈉的添加量呈正相關(guān)關(guān)系。添加三磷酸鈉亦使損耗角正切值變大。

圖2 焦磷酸鈉對(duì)面筋蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.2 Effect of TSPP on rheological properties of gluten

圖3 三聚磷酸鈉對(duì)面筋蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.3 Effect of STPP on rheological properties of gluten

圖4 六偏磷酸鈉對(duì)面筋蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.4 Effect of SMP on rheological properties of gluten

從圖4a 可知，添加不同比例的六偏磷酸鈉后，面筋蛋白的儲(chǔ)能模量均有所提高。當(dāng)添加量為0.4%，0.8%時(shí)，儲(chǔ)能模量值均達(dá)較高水平。從圖4b可知，六偏磷酸鈉添加量對(duì)面筋蛋白損耗模量的影響與焦磷酸鈉相似，六偏磷酸鈉添加量為0.8%時(shí)，面筋蛋白損耗模量達(dá)到最大值。六偏磷酸鈉對(duì)損耗角正切值的影響與焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉相似。

圖5 添加不同磷酸鹽后面筋蛋白在25 ℃、0.5 mmol/L 乙酸溶液中的散射曲線Fig.5 Scattering curves of gluten proteins with different phosphates at 25 ℃and 0.5 mmol/L acetic acid solution

對(duì)比圖2a、圖3a、圖4a 可知，磷酸鹽對(duì)面筋蛋白的儲(chǔ)能模量的影響不同，焦磷酸鈉的影響最為顯著，六偏磷酸鈉次之，三聚磷酸鈉的影響較小。用儲(chǔ)能模量表征面筋蛋白的彈性性能，通過適當(dāng)添加焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉均能改善面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高面筋蛋白的彈性。由圖2b、圖3b、圖4b 可知，添加磷酸鹽均能提高面筋蛋白的損耗模量，增加面筋蛋白的黏性。這可能是由于添加磷酸鹽后，引入部分電荷，使面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得以舒展，增強(qiáng)了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)的黏彈性[8]。添加磷酸鹽后面筋蛋白流變學(xué)損耗模量G"與損耗角正切值tanδ 值均有所增大，且損耗角正切值始終小于1，這表明磷酸鹽雖使面筋蛋白體系的類固體特性減弱，但始終沒有改變面筋蛋白體系的類固體性質(zhì)[12]。

2.3 小角X-散射試驗(yàn)結(jié)果

將添加不同磷酸鹽后制得的面筋蛋白溶解于0.5 mmol/L 乙酸溶液中，進(jìn)行X-小角散射（SAXS）試驗(yàn)，結(jié)果如圖5 和圖6 示。

圖5a、5b 和5c 分別顯示添加不同量焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉后面筋蛋白的散射曲線，可以看出，當(dāng)散射矢量q 值在0.16 nm-1左右時(shí)，所有樣品有1 個(gè)明顯的峰值，表明面筋蛋白結(jié)構(gòu)在溶液中完全展開，無分子間相互作用的影響，可忽略溶劑對(duì)面筋蛋白分子鏈的影響。

圖5a、5b 和5c 分別顯示添加焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉后面筋蛋白Guinier 散射曲線。其中，橫縱坐標(biāo)q 和I 分別表示散射矢量和散射強(qiáng)度。Guinier 散射曲線反映蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象。添加3 種磷酸鹽，在小角范圍內(nèi)，不同濃度下面筋蛋白溶液的q2-ln[I（q）]均滿足線性關(guān)系，表明面筋蛋白在乙酸溶液中呈相對(duì)單一的尺寸，有相近的構(gòu)象。

從圖6a、6b 和6c 可知，添加三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉對(duì)面筋蛋白分子質(zhì)量無顯著影響，然而，添加焦磷酸鈉后蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量略有增大趨勢(shì)，各添加量間無明顯差異。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布較寬，而X-小角散射測(cè)定結(jié)果僅反映其分子質(zhì)量的平均變化值，這種變化主要集中在什么范圍，還有待研究。

圖6 不同磷酸鹽對(duì)面筋蛋白Guinier 散射曲線的影響Fig.6 Effect of different phosphates on the Guinier scattering curve of wheat gluten

2.4 面筋蛋白結(jié)構(gòu)

取1 600～1 700 cm-1段譜圖，用PeakFit v4.12軟件分析。先進(jìn)行高斯去卷積處理，再由二階導(dǎo)數(shù)擬合得到特征峰。以特征峰的位置為參數(shù)，對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算峰面積，確定面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量所占的比例。添加3 種磷酸鹽后面筋蛋白傅里葉紅外光譜特征曲線如圖7所示。

圖7a、7b 和7c 分別表示添加焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉后面筋蛋白的傅里葉紅外光譜特征曲線。可以看出，添加不同磷酸鹽后紅外曲線的走勢(shì)和出峰位置基本一致，而在酰胺Ⅰ帶位置擬合的各峰大小略有不同，表明磷酸鹽的添加未改變面筋蛋白的特征基團(tuán)，而僅對(duì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量有所影響。

由表2 可知，添加焦磷酸鈉后，面筋蛋白體系中的β-折疊片層結(jié)構(gòu)與分子內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)的含量均有所增加，當(dāng)添加量為0.8%時(shí)，影響較為顯著；對(duì)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、α-螺旋結(jié)構(gòu)無顯著的影響，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與分子間非平面弱氫鍵結(jié)構(gòu)略有降低。β-折疊與α-螺旋結(jié)構(gòu)是蛋白中較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，添加焦磷酸鈉后面筋蛋白體系中β-折疊結(jié)構(gòu)有所增加，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)略有降低，這使面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可能是引起面條質(zhì)構(gòu)性能——硬度、黏結(jié)性、咀嚼性增加的一個(gè)因素。這是由于添加焦磷酸鈉后，體系電荷增加，面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)，使面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加有序，最終表現(xiàn)為對(duì)面條質(zhì)構(gòu)特性的影響[13]。

由表3 可知，添加三聚磷酸鈉對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小，總體β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)與分子間非平面氫鍵含量并無明顯變化，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)略有降低，說明三聚磷酸鈉雖對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小，但使面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

從表4 可知，添加六偏磷酸鈉，對(duì)面筋蛋白體系中各二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)其添加量較低時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊片層結(jié)構(gòu)與分子內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)含量均有所降低；當(dāng)其添加量為0.6%時(shí)，隨著六偏磷酸鈉添加量的增加，β-折疊片層結(jié)構(gòu)與分子內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)含量均增加。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量不受六偏磷酸鈉的影響。然而，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)以及分子間非平面弱氫鍵結(jié)構(gòu)隨六偏磷酸鈉添加量的增加，發(fā)生同樣的變化。當(dāng)六偏磷酸鈉添加量較低時(shí)，隨著六偏磷酸鈉添加量的增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)以及分子間非平面弱氫鍵結(jié)構(gòu)含量均略有增加，當(dāng)六偏磷酸鈉添加量超過0.4%時(shí)，隨著添加量的增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)以及分子間非平面弱氫鍵結(jié)構(gòu)含量隨之降低，說明添加一定量的六偏磷酸鈉后，面筋蛋白體系中的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，使面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)定，這也可能是六偏磷酸鈉使面條硬度降低的因素之一。

從以上試驗(yàn)結(jié)果來看，不同的磷酸鹽對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響各有不同，添加焦磷酸鈉使得面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，添加三聚磷酸鈉對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小，也使面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，而添加六偏磷酸鈉使面筋蛋白結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定。綜上，在面條加工過程中磷酸鹽的種類及其添加量對(duì)面條的品質(zhì)有重要的影響。

圖7 面筋蛋白傅里葉紅外光譜特征曲線Fig.7 Fourier infrared spectrum characteristic curve of gluten

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：3 種磷酸鹽對(duì)面筋蛋白流變學(xué)特性有不同程度的影響。焦磷酸鈉的添加量過低或過高，均會(huì)降低面筋蛋白的彈性。當(dāng)其添加量為0.4%，0.8%時(shí)，面筋蛋白的黏彈性有所增強(qiáng)。添加三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉均提高了面筋蛋白的黏彈性。添加焦磷酸后，面筋蛋白平均分子質(zhì)量略有增加，而三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉對(duì)其影響不顯著。添加焦磷酸鈉使面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。添加三聚磷酸鈉雖對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小，但也使面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，而添加六偏磷酸鈉使得面筋蛋白結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)定。

表2 焦磷酸鈉對(duì)面筋蛋白酰胺Ⅰ帶特征普帶歸屬及含量的影響Table 2 Effect of TSPP on the distribution and content of the gluten I branch

表3 三聚磷酸鈉對(duì)面筋蛋白酰胺Ⅰ帶特征普帶歸屬及含量的影響Table 3 Effect of STPP on the characteristics and content of fascinating amine I

表4 六偏磷酸鈉對(duì)面筋蛋白酰胺Ⅰ帶特征普帶歸屬及含量的影響Table 4 Effect of SMP on the characteristics and content of fascinating amine I