氧化石墨烯指數(shù)富集法篩選食品中的組胺適配體

朱勤超，馮俊麗，2*，戴志遠(yuǎn)，2，汪 藝

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012）

組胺（histamine，HA）是在許多食物（例如葡萄酒、奶酪、蔬菜和魚(yú)類(lèi)等）中以各種水平存在的一種生物胺（biogenic amine，BA）。大部分由生物胺造成的食源性中毒事件都與組胺有一定聯(lián)系[1]。低濃度組胺參與重要神經(jīng)生理功能的調(diào)節(jié)，如機(jī)體運(yùn)動(dòng)、體溫控制、膽固醇及膽汁酸代謝和免疫反應(yīng)[2]。然而，食品和飲料中高濃度的組胺對(duì)人體具有毒性作用，會(huì)引起腹瀉、惡心、嘔吐、心悸、頭疼、心肌缺血和急性肺水腫等癥狀[3]。在食品加工和儲(chǔ)存期間，組胺通常由微生物對(duì)環(huán)境中游離的組氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生。反應(yīng)中涉及的外源組氨酸脫羧酶由相關(guān)的微生物釋放。這些微生物有些存在于活魚(yú)的正常微生物菌群（主要是腸道細(xì)菌）中，然而大多數(shù)似乎來(lái)自漁船上、加工廠和運(yùn)輸系統(tǒng)的污染[4]。除了衛(wèi)生條件外，食品加工方法的其它因素，如其儲(chǔ)存溫度和時(shí)間對(duì)組胺生成也有一定影響。

值得注意的是，食物中的組胺一旦形成通常不會(huì)被高溫破壞[5]。食品中組胺的存在及含量非常重要，它通常作為食品變質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)，也是食品生產(chǎn)加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中質(zhì)量控制、監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物之一[6]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前鑒定、定量組胺的分析方法有：毛細(xì)管電泳技術(shù)[7-9]、氣相色譜[10-11]、薄層色譜[12]、高效液相色譜[13]、比色法和熒光法[14]等。這些方法成本高，耗時(shí)且需要復(fù)雜的設(shè)備，亟待構(gòu)建一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、速度快、靈敏度高的組胺檢測(cè)方法。

適配體是由寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)通過(guò)指數(shù)富集篩選而獲得。適配體的體外選擇過(guò)程涉及特異結(jié)合，分離和擴(kuò)增[15-16]。適配體可以靶向多種分子結(jié)構(gòu)，如金屬離子、生物毒素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒等[17-19]。適配體折疊成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而具有與抗體相當(dāng)?shù)挠H和性和特異性，可識(shí)別相應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)[20]。此外，與抗體相比，適配體具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)[21-23]：快速可重復(fù)的合成，簡(jiǎn)單可控的精確修飾，以滿足不同分析、臨床診斷和治療。其穩(wěn)定性好且可逆變性，至今未發(fā)現(xiàn)免疫原性，具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期。作為抗體替代物，新出現(xiàn)的適配體成為檢測(cè)特定靶標(biāo)的理想識(shí)別元件，得到國(guó)內(nèi)外科研人員的廣泛研究[24]。

近年來(lái)，篩選用于分子質(zhì)量較小的靶標(biāo)檢測(cè)的適配體方法主要包括磁珠法[25]、親和柱層析法[26]和氧化石墨烯法[27]等。本試驗(yàn)中采用氧化石墨烯法作為ssDNA 篩選分離的指數(shù)富集方法，不需要改變組胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不需要活化組胺并將其固定于載體上，只需將氧化石墨烯加入反應(yīng)體系中吸附去除未與組胺結(jié)合的游離ssDNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中組胺適配體的篩選[28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺、氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、L-組氨酸鹽酸鹽、血清素、5-羥色胺，上海生工生物技術(shù)有限公司；高保真PCR 酶、50 bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)品、瓊脂糖，大連寶生物工程（Takara）有限公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 隨機(jī)文庫(kù)構(gòu)建和引物合成

建立長(zhǎng)度為81nt 的單鏈DNA 隨機(jī)文庫(kù)：5′AGT ATA CGT ATT ACC TGC AGC（N 40）CGA TAT CTC GGA GAT CTT GC 3′，兩端為固定序列，中間N40 為含40 個(gè)堿基的隨機(jī)序列。隨機(jī)ssDNA 文庫(kù)和引物均由上海生工生物工程有限公司合成。用TE 緩沖液配成濃度2 nmol/L 貯液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）與瓊脂糖凝膠電泳

利用PCR 將每輪篩選獲得的ssDNA 作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL（20 mmol/L），下游引物1 μL（20 mmol/L），2× 預(yù)混液10 μL，滅菌超純水6 μL，總體積為20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)25 次，最后72 ℃延伸2 min。利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照分析，觀察電泳條帶是否單一，位置是否正確。

1.4 GO-SELEX 篩選方法

參考文獻(xiàn)[29]的方法，將氧化石墨烯加入反應(yīng)體系中吸附去除未與組胺結(jié)合的游離ssDNA。本試驗(yàn)中，將組胺溶于超純水，配成2 nmol/L 的溶液。配制15 mg/mL GO，超聲至均勻懸浮體系，使用前充分混勻。

在第1 輪篩選時(shí)，隨機(jī)ssDNA 文庫(kù)使用量為20 μL，組胺溶液用量為20 μL。首輪篩選體系為600 μL，在1 × 結(jié)合緩沖液（0.85% NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中25 ℃反應(yīng)2.5 h，加入100 μL 氧化石墨烯吸附30 min，然后，13 000 r/min 離心10 min，取其上清液，重復(fù)3 次，充分去除殘留氧化石墨烯。將離心獲得的上清液作為PCR 擴(kuò)增的模板，PCR 擴(kuò)增所得ssDNA 通過(guò)純化、酶切、純化及變性后作為第2 輪篩選所需文庫(kù)。

為提高適配體篩選的特異性，每2 輪正篩后進(jìn)行1 輪反篩，即分別在第3，6，9 輪用L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進(jìn)行反向篩選。反篩過(guò)程與正篩基本相同，在結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，離心收集不與反篩物結(jié)合的上清液，直接作為模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增。11 輪篩選所得ssDNA 經(jīng)純化，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司序列分析。

1.5 適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，并用在線程序Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和模擬。

1.6 適配體結(jié)合特異性分析

氧化石墨烯不僅能強(qiáng)吸附游離的單鏈DNA，而且具有極好的熒光淬滅作用，能將吸附在其表面的熒光基團(tuán)猝滅[29]。將測(cè)序所得序列通過(guò)分析挑選2 種代表性序列，在其5-端進(jìn)行FAM 標(biāo)記，分別與組胺、L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺在25 ℃搖床孵育2 h，加入GO 吸附并淬滅未結(jié)合的熒光標(biāo)記ssDNA。反應(yīng)結(jié)束后用F-7000 熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，光電倍增電壓800 V 的條件下檢測(cè)孵育液的熒光強(qiáng)度（F）。共重復(fù)3 次試驗(yàn)，以不加適配體的為空白對(duì)照組，不加靶標(biāo)物并不用氧化石墨烯吸附的為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.7 適配體親和力測(cè)定

各適配體與HA 的親和常數(shù)測(cè)定方法是：將HA 與不同濃度的適配體（0～80 nmol/L）結(jié)合2 h，然后按照1.6 節(jié)方法計(jì)算不同濃度時(shí)的親和力，并以適配體濃度為橫坐標(biāo)，親和力為縱坐標(biāo)作圖。利用Origin 8.0 軟件擬合每條適配體的飽和曲線，計(jì)算其解離常數(shù)Kd值。

圖1 基于氧化石墨烯的組胺的SELEX 篩選原理圖Fig.1 SELEX of Histamine based on Graphene Oxide（GO）

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體篩選流程

第1 輪、第2 輪為正篩，以富集到更多的與組胺相結(jié)合的ssDNA。當(dāng)富集的ssDNA 達(dá)到一定的數(shù)量，加入L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進(jìn)行反篩，以增強(qiáng)適配體的特異性。經(jīng)11 輪SELEX 篩選，測(cè)序獲得15 條候選適配體序列，見(jiàn)表1。其中有6 個(gè)適配子的序列（HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14）在測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)5 次以上，是高頻適配子。

表1 測(cè)序得到的15 條適配體序列Table 1 15 Aptamer sequences by test

2.2 適配體一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用DNAMAN 軟件對(duì)15 條序列進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析，得到相應(yīng)的同源樹(shù)（圖2）。依據(jù)該同源樹(shù)將這15 條序列分成3 個(gè)家族（表2）。從表2 可看出，同源性較高的第1 家族集中了57.7%的適配體，大部分高頻出現(xiàn)的適配體在這個(gè)家族。這表明GO-SELEX 篩選具有很好的富集作用。

2.3 候選適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在測(cè)序結(jié)果中適配體出現(xiàn)的頻率越高，意味著其在富集庫(kù)中的占比越較高，對(duì)組胺的親和力也越高。從3 家族中選擇高頻出現(xiàn)的適配體HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14。利用在線程序Mfold 對(duì)這6 條高頻適配體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬。比較每個(gè)適配體的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，適配體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

基于ssDNA 折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要通過(guò)自由能衡量，自由能越小，折疊結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[23]。對(duì)這6 條適配體的自由能進(jìn)行比較，HAA-4 最小自由能為-6.87 kcal/mol，明顯小于其它5 條適配體的自由能，表明相比其它適配體，其二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。圖3 可見(jiàn)HAA-4 為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為1 個(gè)大環(huán)和2 個(gè)小環(huán)，而莖環(huán)結(jié)構(gòu)正是適配體與靶標(biāo)組胺結(jié)合的基礎(chǔ)。

圖2 組胺適配體同源樹(shù)Fig.2 Homology tree of aptamers against Histamine

2.4 適配體特異性分析

所挑選的高頻適配子對(duì)HA 的結(jié)合特異性分析見(jiàn)圖4。HAA-4 和HAA-7 對(duì)HA 的親和特異性較高。后續(xù)只選HAA-4 和HAA-7 適配子進(jìn)行親和常數(shù)的測(cè)定。

表2 基于同源樹(shù)的組胺適配體分類(lèi)Table 2 Classification of aptamers against histamine based on the homology tree

圖3 預(yù)測(cè)的組胺適配體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted secondary structures of Histamine aptamer sequences

圖4 4 種高頻適配體特異性分析Fig.4 Analysis of specificities of the four high-frequency aptamers

圖5 組胺適配體的解離常數(shù)飽和曲線Fig.4 Saturation curves of dissociation constant（Kd）of Histamine aptamer

2.5 適配體親和性分析

測(cè)定HAA-4 和HAA-7 適配子的親和常數(shù)，其中適配子HAA-4 的親和常數(shù)飽和曲線見(jiàn)圖5，呈較好的擬合效果，適配子與菌體之間的親和常數(shù)Kd=48.37 nmol/L。適配子HAA-7 的飽和曲線與圖4 類(lèi)似，親和常數(shù)Kd=39.73 nmol/L。根據(jù)親和常數(shù)越小，適配體與靶標(biāo)的親和力越大的原則，適配子HAA-7 對(duì)HA 的親和力更大。

3 結(jié)論

本研究中，利用基于氧化石墨烯的SELEX 技術(shù)，對(duì)組胺進(jìn)行11 輪的篩選，分別在第3，6，9 輪用L-組氨酸鹽酸鹽、血清素及5-羥色胺進(jìn)行反向篩選，最終獲得高度親和性和特異性的15 條適配體序列。通過(guò)適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)、親和性和特異性分析，最終HAA-4 和HAA-7 被確定為最佳候選適配體，有望用于食品中組胺的定性、定量分析。未來(lái)的工作是確定對(duì)組胺候選配體進(jìn)行化學(xué)改性和修飾，開(kāi)發(fā)基于對(duì)組胺精確識(shí)別的適配體的低成本、高靈敏的新型組胺檢測(cè)方法。