清醬肉體外模擬消化后粗肽的抗氧化活性和氨基酸分析

王 樂，李 享，劉文營，賈曉云，曲 超，成曉瑜，趙 冰

（中國肉類食品綜合研究中心 北京食品科學(xué)研究院 國家肉類加工工程技術(shù)研究中心肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100068）

清醬肉一般具有色澤鮮明，清香微膩，香味濃郁，風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)，有一定的研究價(jià)值[1]。肉類通常是當(dāng)今消費(fèi)者攝取高品質(zhì)蛋白質(zhì)以及必需氨基酸的主要來源之一[2]。據(jù)報(bào)道[3]，可從肉或肉制品提取出具有生物活性的物質(zhì)，如抗氧化肽。肉類中的生物活性肽可以通過水解、消化或在加工過程（發(fā)酵、成熟）中產(chǎn)生[4-6]。大量研究證明，肽的抗氧化性很大程度上取決于分子質(zhì)量大小，氨基酸構(gòu)成和肽的序列等因素[7-8]。Xing 等[9]從宣威火腿中分離純化得到抗氧化肽，經(jīng)質(zhì)譜鑒定序列為Asp-Leu-Glu-Glu 的四肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力。Sun等[10]從廣式臘腸中提取的多肽液具有較高的DPPH·清除能力。劉芝君等[11]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物蛋白復(fù)合酶酶解四川臘肉得到的產(chǎn)物具有較好的抗氧化效果。

通常與干腌肉制品中抗氧化肽相關(guān)的研究一般用鹽酸或磷酸作為提取液，測(cè)定所提多肽的含量及其抗氧化能力[12]。肉類一般不直接食用，通常需要先經(jīng)過加熱烹飪，在人體內(nèi)消化后才可吸收其營養(yǎng)成分或發(fā)揮生物功能[13-15]。然而，在胃、腸道的消化過程中，消化酶、極端pH 值、無機(jī)鹽及其它條件可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)構(gòu)或活性產(chǎn)生一定的影響[16]。甚至有研究報(bào)道：食源性短肽服用之后，易于被胃、腸道消化酶降解而喪失其本來的生物功能[17]。由消化酶水解食源性蛋白所制備的短肽則具有較好的抗消化酶降解能力，與相同組成的游離氨基酸比較更容易被機(jī)體所吸收[18]。陳晨等[19]研究發(fā)現(xiàn)米發(fā)糕經(jīng)胃、腸消化后蛋白質(zhì)充分降解，從而增加了更多具有抗氧化能力的基團(tuán)暴露在胃、腸道中的可能性。與化學(xué)提取法對(duì)比，通過體外模擬胃、腸消化清醬肉所得粗肽能更好地反映和模擬其在生理?xiàng)l件下的生物活性表現(xiàn)。

目前雖然有從干腌肉制品中提取天然抗氧化肽的報(bào)道，但是大部分集中在從火腿中提取具有生物活性的肽，針對(duì)從臘肉中提取抗氧化肽的研究比較少[20-21]。尤其是目前關(guān)于模擬胃、腸道消化，從臘肉中提取粗肽并對(duì)其抗氧化性的研究鮮見報(bào)道。本文以清醬肉為原料，模擬胃、腸道消化提取粗肽，通過DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、總抗氧化能力（FRAP）、Fe2+螯合能力和還原能力等主要指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗氧化能力，并對(duì)酶解粗肽進(jìn)行氨基酸分析，探索清醬肉在胃、腸道環(huán)境下的抗氧化活性和粗肽的生物有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬五花肉，北京二商大紅門肉類食品有限公司；加工輔料，中國肉類食品綜合研究中心香辛料部。

DPPH、鄰二氮菲，美國Sigma 公司；鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（TCA），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS 抗氧化能力檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP 法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104 分析天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；Evolution 220 紫外-可見分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾科技公司；SYNERGY H4 酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；日立L-8900 氨基酸分析儀，日本日立公司；D-500 勻漿機(jī)，德國WIGGENS 公司；Sorvall LYNX-4000 型離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；LGJ-30D 冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；

1.3 方法

1.3.1 清醬肉的加工工藝 根據(jù)王樂等[6]的方法，以豬五花肉為原料制作清醬肉，共重復(fù)3 批次。

1.3.2 體外模擬消化清醬肉提取粗肽 參考Simonetti 等[22]的方法模擬胃、腸消化。將五花肉和清醬肉剔掉脂肪，分別將瘦肉絞碎后裝入袋中，75℃水浴煮30 min。取煮后樣品30 g，加入250 mL去離子水，低速均質(zhì)1 min，用1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)勻漿液pH 值至2.0，按照酶∶底物（m/m）為1∶100 的比例加入胃蛋白酶，混勻后37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩2 h，用1 mol/L NaHCO3溶液將酶解液pH值調(diào)至7.2，終止反應(yīng)。按照酶∶底物（m/m）為1∶50的比例添加胰酶，混勻后于37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩3 h，反應(yīng)結(jié)束后在95 ℃水浴中保持10 min 使酶失活。冷卻后10 000×g 離心20 min，抽濾上清液后冷凍干燥，即清醬肉經(jīng)模擬胃、腸消化所得粗肽樣品和五花肉經(jīng)模擬消化所得粗肽樣品。

1.3.3 DPPH·清除測(cè)定 參考Wang 等[23]的方法，分別將模擬胃、腸消化后所提取的清醬肉粗肽和五花肉粗肽配成質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5 mg/mL 的粗肽液，將0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇）和粗肽液以體積比1∶1 混合均勻，室溫避光放置30 min 后測(cè)517 nm 處的吸光度，記樣品管。對(duì)照管為0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇）與去離子水按體積比1∶1 混合，空白管為樣品液與95%乙醇按體積比1∶1 混合。DPPH·清除率計(jì)算如下：

1.3.4 Fe2+螯合能力的測(cè)定 參考Lee 等[24]的方法，分別將模擬胃、腸消化后所提取的清醬肉粗肽和五花肉粗肽配成質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5 mg/mL 的粗肽液。將1 mL 粗肽液與0.05 mL FeCl2（2 mmol/L）混合，振蕩混勻后加入0.2 mL 菲洛嗪（5 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，劇烈混勻，靜置10 min后測(cè)定其在波長562 nm 處的吸光度。計(jì)算Fe2+螯合率。

式中：A樣品——樣品組所測(cè)吸光度值；A空白——去離子水代替樣品所測(cè)吸光度值。

1.3.5 還原力的測(cè)定 參考蔡俊等[25]的方法，分別將模擬胃、腸消化后所提取的清醬肉粗肽和五花肉粗肽配成質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5 mg/mL的粗肽液。將1 mL 粗肽液加入2 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.6）中，與2 mL 1 g/100 mL K3[Fe（CN）6]溶液混合，振蕩均勻，在50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，快速冷卻。加入2 mL TCA（10 g/100 mL），充分混勻，4 000 r/min 離心10 min。取2 mL 上清液，加2 mL 去離子水和0.4 mL FeCl3溶液（0.1 g/100 mL），振蕩混勻后放置10 min，之后測(cè)定A700nm。

1.3.6 ABTS＋·清除能力測(cè)定 根據(jù)ABTS 抗氧化能力檢測(cè)試劑盒方法測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果用單位質(zhì)量（g）的肽等同于trolox 物質(zhì)的量（TEAC）表示，單位為mmol Trolox/g。

1.3.7 總抗氧化能力（FRAP）的測(cè)定 按照試劑盒方法，于波長593 nm 處測(cè)定吸光度。用試劑盒提供的FeSO4·7H2O 配制不同濃度的FeSO4·標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每克肽相當(dāng)于FeSO4的物質(zhì)的量表示，單位為mmol FeSO4/g。

1.3.8 總氨基酸組成分析 將清醬肉粗肽粉溶解，置于裝有15 mL 6 mol/L HCl 的水解玻璃管中，抽真空，充入氮?dú)猓貜?fù)3 次后封口，于110 ℃水解22 h，冷卻后過濾，定容50 mL。將1 mL 濾液加入試管中蒸發(fā)至干，之后用1 mL 檸檬酸鈉緩沖液（pH 2.2）復(fù)溶，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，以備上機(jī)分析。

1.3.9 游離氨基酸組成分析 參考Mirae 等[26]的方法，將一定量清醬肉粗肽粉溶解于20 mL 去離子水中，加入20 mL 10%磺基水楊酸，振蕩均勻，4℃反應(yīng)15 h，使大分子蛋白質(zhì)沉淀，之后4 ℃離心（12 000×g，20 min），取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，以備上機(jī)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)，用Origin 8.0 軟件作圖。采用SPSS 22.0 軟件分析方法中的Duncan’s 多重比較做數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH·的清除效果

DPPH·清除法是常用的抗氧化性評(píng)價(jià)方法[27]。由圖1 可知，模擬消化后，五花肉與清醬肉粗肽液都表現(xiàn)出一定的DPPH·清除能力。當(dāng)清醬肉粗肽質(zhì)量濃度為1～3 mg/mL 時(shí)，隨著濃度的升高，清除率逐漸增強(qiáng)；當(dāng)清醬肉粗肽質(zhì)量濃度大于3 mg/mL 時(shí)，DPPH·清除率變化緩慢；當(dāng)清醬肉粗肽質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時(shí)，清醬肉粗肽液對(duì)DPPH·的清除率達(dá)81.41%，顯著高于同濃度的五花肉粗肽（P ＜0.05）。Zhu 等[28]用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化金華火腿，所得產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時(shí)，其DPPH·清除率為57.50%。

DPPH·清除活性可能與疏水性氨基酸含量相關(guān)。據(jù)報(bào)道蛋白酶解物具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，與其所含較多的疏水性氨基酸或肽有關(guān)[21，29]。從清除DPPH·方面考慮，推測(cè)模擬胃、腸消化后清醬肉粗肽中可能包含一些由疏水性氨基酸組成的肽段。

2.2 Fe2+螯合能力

機(jī)體內(nèi)的很多氧化反應(yīng)都需要過渡金屬離子的催化，如Fe2+催化巰基化合物的自氧化，促使自由基的形成（如氧自由基和羥自由基），進(jìn)而產(chǎn)生破壞人體健康和食品組分的物質(zhì)[30]。螯合Fe2+能力大小常用來評(píng)價(jià)樣品抗氧化的能力。

由圖2 可知，模擬消化后，隨著粗肽濃度的升高，五花肉粗肽液和清醬肉粗肽液的螯合Fe2+的能力均呈上升趨勢(shì)。清醬肉粗肽的Fe2+螯合能力從質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)的7.47%增至質(zhì)量濃度5 mg/mL 時(shí)的30.45%，顯著高于五花肉粗肽（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)短肽中暴露的中性和酸性氨基酸因其含有的游離羧基與Fe2+形成螯合物，而減少機(jī)體自由基的形成[31-32]。清醬肉粗肽較高的Fe2+螯合能力可能和酶解物包含較多可與Fe2+螯合的中性和酸性氨基酸肽段相關(guān)。

圖1 清醬肉粗肽液和五花肉粗肽液對(duì)DPPH·的清除效果Fig.1 DPPH free radicals scavenging effect of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

圖2 清醬肉粗肽液和五花肉粗肽液對(duì)Fe2+的螯合率Fig.2 Fe2+ chelating effect of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

2.3 還原能力

還原力在一定程度上可以表示抗氧化劑提供電子的能力。據(jù)報(bào)道，抗氧化能力和還原力呈正相關(guān)[33]。如圖3所示，模擬消化后，清醬肉粗肽的還原力隨濃度的上升而逐漸提高，在其質(zhì)量濃度5 mg/mL 時(shí)還原力的吸光度值最大，是五花肉粗肽的3.26 倍，且始終顯著高于五花肉粗肽（P＜0.05），這說明清醬肉粗肽的抗氧化能力隨濃度的上升而增強(qiáng)。劉文穎等[34]指出粗肽的還原能力可能是部分具有供氫能力的氨基酸殘基引起的。樊梓鸞等[13]發(fā)現(xiàn)消化酶可以促進(jìn)抗氧化活性物質(zhì)的釋放，胃、腸消化后使樣品形成更多的小肽和氨基酸等物質(zhì)，因此模擬消化后清醬肉粗肽有更優(yōu)的抗氧化活性。

2.4 ABTS＋·清除能力

ABTS＋·清除能力也常被用作考察樣品的抗氧化能力[35]。如圖4 可知，相對(duì)于五花肉粗肽，清醬肉粗肽的抗氧化性更高，差異性顯著。這與具有抗氧化能力的肽鏈長度一般較短有關(guān)，而清醬肉加工過程中由于內(nèi)源酶的存在會(huì)發(fā)生降解，生成豐富的多肽和小肽，因此清醬肉粗肽的ABTS＋·清除率較高（0.337 mmol Trolox/g）。Gallego 等[8]用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化干腌火腿副產(chǎn)物所得粗肽的ABTS＋·清除活性為0.220 mmol Trolox/g。這可能是因?yàn)槟M胃、腸消化能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)降解為小肽或游離氨基酸，極性基團(tuán)含量增加，從而使親水性提高[36]。

2.5 總抗氧化能力（FRAP）

FRAP 法反映的不是樣品針對(duì)某一種自由基的清除能力，因此常用來評(píng)價(jià)樣品的總抗氧化活性[37]。由圖4 可知，模擬消化后，五花肉粗肽和清醬肉粗肽均具有一定的FRAP 能力。清醬肉粗肽的FRAP 為0.121 mmol FeSO4/g，是五花肉粗肽的3.44 倍。據(jù)Ahhmed 等[38]報(bào)道腸胃、模擬消化過程中強(qiáng)烈的蛋白水解會(huì)促使許多具有生物活性的低分子質(zhì)量肽生成。這可能是因?yàn)榍遽u肉模擬消化后進(jìn)一步降解的低分子質(zhì)量多肽組分是很好的氫或電子供應(yīng)體，具有較好的總抗氧化能力。

圖3 清醬肉粗肽液和五花肉粗肽液的還原力Fig.3 The reduction ability of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

圖4 清醬肉粗肽液和五花肉粗肽液的ABTS＋·清除能力和總抗氧化能力（FRAP）Fig.4 The ABTS＋· scavenging capacity and FRAP of the crude peptides extract from pickled sauced meat and pork belly

2.6 氨基酸分析

一般來說，肽的生物活性與氨基酸組成、序列和疏水性等密切相關(guān)[39]。據(jù)報(bào)道，肽段中含有的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）和堿性氨基酸（組氨酸、精氨酸、賴氨酸）使抗氧化肽具有較強(qiáng)的金屬離子螯合能力和自由基清除活性[40]。此外，肽鏈中含有疏水性氨基酸（如Tyr、Ala、Met、Val、Phe、Ile、Leu 和Pro）往往具有較高的抗氧化活性[41]。黃湛媛等[42]發(fā)現(xiàn)Gly-Asn-Gly-Leu-Pro 的結(jié)構(gòu)對(duì)自由基清除有重要影響。宣威火腿中序列為 Asp-Leu-Glu-Glu 肽被發(fā)現(xiàn)有良好的抗氧化性[9]。葛曉鳴等[39]發(fā)現(xiàn)海馬酶解多肽中疏水性氨基酸Tyr、Met、Phe 對(duì)其抗氧化活性貢獻(xiàn)較多，這也許是因?yàn)槭杷园被嶙鳛楣潴w，可與自由基反應(yīng)增強(qiáng)粗肽的抗氧化能力，也可能是疏水性氨基酸更易于和金屬離子螯合，或是由于具有疏水性能更好的存在于水-脂質(zhì)界面處，從而提高多肽的自由基清除能力。由表1所示，經(jīng)模擬消化，清醬肉最終產(chǎn)物組成中游離氨基酸占29.92%，表明有70%左右的最終消化產(chǎn)物是以肽的形式存在的，有利于吸收和表現(xiàn)抗氧化活性。清醬肉經(jīng)模擬消化，粗肽中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的39.47%，說明清醬肉經(jīng)胃、腸酶消化所得粗肽仍有一定的營養(yǎng)價(jià)值。基于總氨基酸含量，粗肽中酸性氨基酸的占比為28.41%，堿性氨基酸的占比為25.21%，疏水性氨基酸的占比為36.04%。這3 種與抗氧化作用有關(guān)的氨基酸占總氨基酸含量的89.66%。

清醬肉經(jīng)模擬胃、腸消化，粗肽中疏水性氨基酸含量較多，有助于促進(jìn)疏水性較強(qiáng)的肽段的形成，因此具有較強(qiáng)的DPPH·清除效果。肽段中的疏水性氨基酸殘基能夠增強(qiáng)肽與食物中脂質(zhì)的相互作用，通過和膜脂雙層發(fā)生疏水作用促使抗氧化劑進(jìn)入靶器官[43]。肽段所具有的較強(qiáng)的ABTS＋·清除活性可能和極性氨基酸（Asp、Glu 和His、Arg、Lys）相關(guān)。粗肽中包含一定量的酸性與中性氨基酸，其側(cè)鏈包含的-NH2和-COOH 能夠和Fe2+緊密結(jié)合，從而發(fā)揮抑制金屬離子催化自由基生成的作用。綜上，清醬肉經(jīng)模擬消化后粗肽表現(xiàn)出較好的總抗氧化能力。結(jié)合氨基酸分析可推斷模擬消化清醬肉后，粗肽的抗氧化活性和其氨基酸組成有關(guān)。基于肽的抗氧化性是由氨基酸組成、序列等因素共同決定，因此仍需對(duì)清醬肉經(jīng)模、擬胃腸消化后所得粗肽的結(jié)構(gòu)等信息進(jìn)行分析和鑒定。

表1 清醬肉粗肽的氨基酸成分分析Table 1 Amino acid composition of the crude peptides extract from pickled sauced meat

3 結(jié)論

本文通過體外模擬胃、腸消化清醬肉，以其原料五花肉為對(duì)照，清醬肉粗肽液的DPPH·清除能力、Fe2＋螯合能力和還原力隨著濃度的增加而增加，顯著高于五花肉粗肽。模擬消化后，清醬肉粗肽的總抗氧化能力（FRAP）是五花肉粗肽的3.44倍。模擬消化后，清醬肉最終產(chǎn)物組成中有70%左右是以肽的形式存在的，且與抗氧化作用有關(guān)的氨基酸占總氨基酸含量的89.66%。由氨基酸分析可知模擬消化后清醬肉粗肽的抗氧化活性與其氨基酸密切相關(guān)，同時(shí)具有一定的營養(yǎng)價(jià)值。體外模擬胃、腸消化促使肉類中生物活性肽的生成。與五花肉粗肽對(duì)比，清醬肉粗肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性。