Capture-SELEX技術篩選β-苯乙胺核酸適配體

糜唯鈺，段 諾，吳世嘉，姬 華，王周平

（石河子大學食品學院 新疆石河子832003）

β-苯乙胺是一種重要的芳香族生物胺，作為中樞神經系統(tǒng)中神經遞質的調節(jié)劑，存在于哺乳動物組織中，高濃度的β-苯乙胺會導致β-內啡肽釋放，誘導產生去甲腎上腺素，從而引發(fā)高血壓和偏頭痛等癥狀[1]。在奶酪、巧克力和腌制肉等食品中都存在β-苯乙胺。其潛在的毒性和作為食品質量標記的可能性，有必要對食品中的β-苯乙胺進行檢測。對β-苯乙胺檢測技術的研究在國內外已經開展多年，目前已建立多種檢測方法，其中最主要的是基于分離技術的儀器分析法，例如高效液相色譜（HPLC）[2-5]，氣相色譜（GC）[6-9]和毛細管電泳（CE）[10-12]等。這些方法可對β-苯乙胺進行精確的定量分析，然而也受到一些因素的限制，如儀器價格昂貴，檢測耗時較長以及需要專門技術人員操作等。

核酸適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），篩選獲得的一種單鏈寡核苷酸（ssDNA 或RNA），可折疊形成三級結構，該結構可特異性識別并結合靶標。核酸適配體不僅具有與抗體相似的親和力和特異性，而且還具有其它優(yōu)點，例如更短的合成時間，更低的制造成本，更少的批次間差異性，更高的可修飾性，更好的熱穩(wěn)定性以及更廣泛的目標種類[13-15]?；诖耍怂徇m配體被廣泛用于臨床診斷和治療劑[16-18]，食品安全檢測[19-21]和環(huán)境監(jiān)測[22-24]等眾多領域。

小分子靶標適配體的篩選大都采用在固相材料表面固定靶標分子的SELEX 技術，該技術存在固定操作復雜，固相材料的空間位阻和靶標分子構象可能改變等缺點?；诠潭╯sDNA 文庫的捕獲SELEX（Capture-SELEX）無需固定靶標分子，避免了上述問題，更適用于可溶性小分子靶標核酸適配體的篩選[25-27]。Capture-SELEX 技術通過特別設計的一段生物素化的反義寡核苷酸鏈，與核酸適配體篩選文庫固定區(qū)域的一端互補結合，從而將ssDNA 文庫固定在抗生物素蛋白包被的磁珠表面。篩選過程中，能夠與靶標形成復合物的適配體從磁珠表面解離，通過收集上清，PCR 擴增，制備單鏈等步驟[28-30]，獲得下一輪篩選的次級文庫。經多輪篩選，就可獲得對靶標具有高親和力和特異性的適配體。

迄今為止，特異性結合β-苯乙胺的ssDNA 適配體尚無報道。本研究通過Capture-SELEX 技術篩選對β-苯乙胺具有高親和力和特異性的ssDNA 適配體，并采用基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的熒光法驗證其親和力與特異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ssDNA 文庫，美國Integrated DNA Technologies（IDT）公司；正向引物P1、磷酸化反向引物P2、生物素標記的互補鏈P3、dNTP mix 和Taq plus DNA 聚合酶（200 U/mL）等，生工生物工程（上海）股份有限公司；β-苯乙胺和酪胺，美國Sigma-Aldrich 公司；酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺、多巴胺，阿拉丁試劑（上海）有限公司；GO，南京先豐納米材料科技有限公司；Lambda 核酸外切酶（5 000 U/mL），New England BioLabs 生物公司；PCR 產物純化試劑盒，上海捷瑞生物有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；尿素【CO（NH2）2】、醋酸鈉（CH3COON a）、氯化鉀（KCl）、氯化鎂（MgC12）和氯化鈉（NaCl）等，均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。參照Duan 等[31]的方法制備親和素包被磁珠。

1.2 儀器與設備

電子天平分析天平（AR224C），奧豪斯儀器中國有限公司；臺式高速冷凍離心機（Centrifuge 54248），德國Eppendorf 公司；分光光度計【UVVis（NIR）UVProbe 2.33 版】，日本島津公司；紫外-可見分光光度計（NanoDrop-2000 微量），美國Thermo Scientific 公司；擴增儀（C 1000 Thermocycler），美國Bio-Rad 公司；垂直電泳系統(tǒng)（Powerpac Basic Power Supply）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM EZ Image），美國Bio-Rad 公司；熒光實時定量PCR 儀（7900HT），美國ABI 公司；多功能酶標儀（Synergy H1），美國BioTek 公司。

1.3 方法

1.3.1 隨機ssDNA 文庫和引物的構建 核酸如表1所示，人工構建合成長度為80 nt 的隨機ss-DNA 文庫，中間為40 nt 的隨機序列區(qū)，兩端固定序列各20 nt，作為PCR 的引物結合區(qū)域，該ssDNA 文庫容量在1014以上。

表1 本研究用DNA 序列Table 1 The DNA sequences used in this study

1.3.2 Capture-SELEX 的篩選流程 Capture-SELEX 篩選流程如圖1所示。

1）文庫固定 設計一條與隨機ssDNA 文庫引物區(qū)互補的互補鏈P3，將其進行生物素標記。第1 輪篩選將1 000 pmol ssDNA 文庫與P3 以物質的量比1∶1.5 加入1 mL 結合緩沖液（Binding buffer，BB）（50 mmol/L Tris-HC1，5 mmol/L KC1，100 mmol/L NaCI，1 mmol/L MgC12，pH 7.4）中，95 ℃變性10 min，在緩慢降溫至37 ℃過程中互補雜交3 h?；パa后ssDNA 文庫與親和素包被磁珠以質量比1∶300 孵育結合，37 ℃，130 r/min 反應6 h，通過親和素與生物素的特異性結合，將ssDNA 文庫固定在磁珠上，用BB 緩沖液清洗3 次以上，去除非特異性結合的ssDNA。孵育結合前、后，采用紫外分光光度法測定上清液中DNA 的紫外吸收，驗證ssDNA 文庫的固定情況。

2）孵育 第1 輪篩選體系為1 mL，固定ss-DNA 文庫的磁珠與靶標（β-苯乙胺，初始濃度為0.1 mmol/L）37 ℃孵育2 h，與靶標特異性結合的ssDNA 從磁珠上解離下來，在緩沖液中形成ssDNA-靶標復合物。從第2 輪開始，篩選孵育體系為300 μL，每輪的篩選條件如表2所示。隨著篩選輪數(shù)的增加，為獲得高親和力的適配體，逐漸增加篩選壓力，包括減少ssDNA 文庫用量，靶標的濃度以及孵育時間。此外，為了提高適配體的特異性，從第5 輪開始進行反篩，加入靶標的結構類似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺作為反篩靶標與ssDNA 文庫孵育，棄包含反篩靶標-ssDNA 復合物的上清液，清洗磁珠后再加入靶標孵育。反篩，可以去除與靶標結構類似物結合的ssDNA。

3）PCR 擴增 在外加磁場作用下，收集與靶標結合的ssDNA，作為模板進行PCR 擴增。

4）酶切 PCR 產物用純化試劑盒純化后，用Lambda 核酸外切酶酶切PCR 產物。酶切產物用酚氯仿抽提法進行純化，乙醇沉淀法回收，獲得下一輪篩選的次級文庫。用NanoDrop 微量紫外-可見分光光度計測定其核酸濃度。

圖1 Capture-SELEX 的篩選流程圖Fig.1 The selection procedure of Capture-SELEX

表2 Capture-SELEX 的篩選條件Table 2 The selection conditions in each round of SELEX

1.3.3 熔解曲線監(jiān)測適配體富集 采用熔解曲線監(jiān)測適配體在篩選過程中的富集情況。實時定量PCR 使用SYBR Green 染料。20 μL 反應體系中含10 μL SYBR Green Master Mix，引物P1 和P2（10 μmol/L）各0.4 μL。以1 μL 富集的文庫作為模板，超純水8.2 μL。PCR 方案：95 ℃預變性5 min，40 個循環(huán)，95 ℃10 s，60 ℃30 s。熔解曲線從軟件7 900 v 2.4 獲得，以此說明適配體篩選過程中的富集程度。

1.3.4 克隆測序及序列分析 最終獲得的ssDNA文庫經PCR 擴增，送生工生物工程（上海）股份有限公司克隆、測序。將測序獲得的40 條序列，用DNAMAN V6 軟件分析其同源性，用Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/）預測其二級結構并計算自由能（△G）。根據(jù)序列同源性，結合二級結構相似性，挑選出重復性高或△G 較低的序列共8 條。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成5' 端標記熒光素亞酰胺（FAM）基團的序列，用于后續(xù)親和力和特異性試驗。

1.3.5 親和力和特異性試驗 基于氧化石墨烯（GO）可吸附熒光標記的核酸適配體序列（ssDNA），不能吸附核酸適配體與靶標結合的復合物的原理構建熒光法測試適配體親和力[32]。取不同濃度（10～200 nmol/L）適配體溶液100 μL，95 ℃變性10 min，立即冰浴。加入β-苯乙胺（10 μmol/L）于37 ℃震蕩孵育2 h。孵育后加入最佳質量比（GO 與適配體的質量比為50∶1）的GO 震蕩孵育30 min，吸附未與靶標結合的ssDNA。在4 ℃條件下，13 000 r/min 離心15 min，用Synergy H1 多功能酶標儀測定上清液的熒光強度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm），以無菌水代替靶標作為陰性對照。通過GraphPad Prism 7.0 軟件擬合相對熒光強度（△F）對不同濃度適配體的非線性飽和結合曲線，計算解離常數(shù)（Kd值）。

式中：F——試驗組的熒光強度；F0——陰性對照組的熒光強度。

對親和力較強的候選適配體進行特異性試驗。分別將靶標及其結構類似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺（10 μmol/L）與適配體孵育，再與GO 震蕩孵育后測定其熒光強度。通過計算和比較相對熒光比例評估適配體的特異性，其中相對熒光比例=△F試驗組/△F靶標，△F試驗組為加入靶標和結構類似物試驗組與陰性對照組熒光強度差值，△F靶標為靶標試驗組與陰性對照組熒光強度差值。以上試驗均做3 次平行重復。

2 結果與分析

2.1 ssDNA 文庫的固定

ssDNA 文庫與生物素標記互補鏈P3 雜交互補后，通過生物素和親和素的特異性結合將ssDNA 文庫固定到磁珠表面，用于后續(xù)篩選。因ss-DNA 在波長260 nm 處有特征吸收峰，故文庫的固定通過紫外分光光度法測定。如圖2所示，固定前測得文庫在260 nm 處的吸光度為0.843，固定后上清液吸光度為0.170，表明文庫全部被固定至磁珠表面。

2.2 溶解曲線監(jiān)測適配體篩選的富集

Capture-SELEX 篩選中，采用溶解曲線監(jiān)測適配體的富集程度。溶解曲線分析與SELEX 方法及靶標性質無關，可作為不同SELEX 篩選方法的通用監(jiān)測工具，并可應用于不同靶標（小分子、蛋白質、細菌和癌細胞）適配體的篩選。PCR 產物的溶解溫度取決于其內部結構和雙鏈體的穩(wěn)定性。文庫在PCR 過程中會形成異源雙鏈和同源雙鏈，其比例取決于序列的多樣性。隨著篩選的進行，與靶標結合的ssDNA 不斷富集，次級文庫的序列多樣性降低。PCR 過程中會形成更多較穩(wěn)定的同源雙鏈，其溶解溫度更高。如圖3所示，溶解溫度在第18 輪達到最大值，表明適配體在篩選過程中已經富集。

圖2 ss-DNA 文庫固定磁珠前、后的紫外吸收圖Fig.2 UV-visible of ss-DNA library before and after immobilized magnetic beads

圖3 Capture-SELEX 篩選2～18 輪的熔解曲線Fig.3 Melting curve of aptamer pool from 2-18 Capture-SELEX rounds

2.3 β-苯乙胺適配體序列分析

將第18 輪ssDNA 文庫克隆測序，共獲得40條序列。根據(jù)DNAMAN V6 和MFold 的分析結果，挑選出重復性高或△G 較低的序列共8 條，作為候選適配體（表3），用作后續(xù)親和力試驗。

表3 β-苯乙胺候選適配體序列Table 3 The sequences of aptamer candidates binding to β-phenylethylamine

2.4 親和力和特異性試驗

GO 的2D 表面結構和優(yōu)異的能量轉移能力使其能夠通過π-π 堆積或氫鍵相互作用強烈吸附生物分子，并通過熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）機制對附近熒光物質進行熒光猝滅[33]。如圖4所示，5'端標記FAM 基團的適配體和靶標孵育后，與靶標結合的適配體形成三維構象，無法與GO 穩(wěn)定吸附結合，熒光基團不會被淬滅。而未與靶標結合的適配體穩(wěn)定吸附在GO 表面，這是由于FRET 機制FAM 基團的熒光被淬滅。經離心分離操作，上清液為靶標-ssDNA 復合物，測定其熒光強度。

圖4 基于GO 熒光分析法驗證適配體親和力的原理Fig.4 The principle of verifying the affinity of aptamers based on GO fluorescence method

2.4.1 氧化石墨烯添加量及孵育時間優(yōu)化 為了保證GO 能完全吸附適配體，需要優(yōu)化試驗中GO的添加量。如圖5所示，隨著GO 的增加，體系中的熒光強度降低。F 為添加GO 孵育后的熒光強度，F(xiàn)0為未添加GO 時體系的熒光強度。當GO 與適配體的質量比為50∶1 時，適配體基本被GO 吸附，熒光淬滅。將GO 與適配體的質量比為50∶1作為后續(xù)試驗中GO 的最佳用量。通過動力學曲線優(yōu)化GO 與適配體的孵育時間。如圖6所示，孵育時間30 min 時，熒光強度幾乎被完全淬滅，因此GO 與適配體的最佳孵育時間為30 min。

圖5 GO 濃度優(yōu)化Fig.5 Optimize GO concentration

圖6 GO 孵育時間優(yōu)化Fig.6 Optimize GO incubation time

2.4.2 β-苯乙胺適配體親和性試驗 采用GO 熒光法測定β-苯乙胺8 條候選適配體序列的親和性，Kd值越小，該序列親和力越強。由圖7 可知，適配體PHE-1、PHE-2 和PHE-8 對β-苯乙胺親和力較強，Kd值分別為（67.54±15.88），（71.64±11.47），（80.46±12.57）nmol/L。選取上述候選適配體繼續(xù)做特異性試驗。

圖7 GO 熒光法驗證β-苯乙胺候選適配體結合飽和曲線Fig.7 The saturation curves of candidate aptamer toward β-phenylethylamine by GO fluorescence method

2.4.3 β-苯乙胺適配體特異性試驗 為了進一步驗證篩選核酸適配體的特異性，進行了反篩。反篩靶標酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組胺、色胺和多巴胺與β-苯乙胺結構相似，且可能同時存在于檢測體系中干擾檢測。選擇親和力好的PHE-1、PHE-2和PHE-8 適配體與上述物質結合，以驗證其特異性。如圖8所示，PHE-1 對酪胺具有一定的結合能力，PHE-2 和PHE-8 特異性較好，并且適配體PHE-2 的Kd值較低【（71.64±11.47）nmol/L】，因此篩選獲得的PHE-2 序列可作為與β-苯乙胺高親和力和特異性結合的適配體。

圖8 GO 熒光法驗證適配體PHE-1、PHE-2和PHE-8 的特異性Fig.8 The specificity of aptamer PHE-1，PHE -2 and PHE-8 verified by GO fluorescence method

3 結論

采用Capture-SELEX 篩選小分子靶標β-苯乙胺的適配體，將第18 輪的PCR 產物克隆測序，共獲得40 條序列。分析序列的同源性和二級結構，挑選出8 條候選適配體序列。采用GO 熒光法進行適配體親和力和特異性試驗。最后獲得一條特異性識別β-苯乙胺的適配體（PHE-2），Kd=（71.64±11.47）nmol/L，表明基于Capture-SELEX技術成功篩選到β-苯乙胺適配體PHE-2，為研究和開發(fā)β-苯乙胺的分析檢測方法提供了新思路。