磷酸化和糖基化對(duì)大豆蛋白體外消化性的影響

劉靜媛，王睿粲，呂 瑩*，郭順堂，邢霽云，楊柏崇

（1 食品質(zhì)量與安全北京市實(shí)驗(yàn)室 北京102206 2 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京102206 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 4 譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司 北京100194）

大豆蛋白是食品加工領(lǐng)域一種重要的蛋白質(zhì)，具有良好的溶解性、乳化性和凝膠性等功能特性[1]，被廣泛應(yīng)用于嬰兒食品、飲料、肉制品和冷凍制品等各類(lèi)加工食品中[1-4]。目前，很多研究對(duì)大豆蛋白進(jìn)行糖基化和磷酸化改性，以提高大豆蛋白的加工性。然而，這兩種改性對(duì)大豆蛋白消化性和吸收的影響如何，目前尚不完全清楚。

蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于氨基酸組成和胃、腸道消化酶解物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收情況。研究顯示，除游離氨基酸外，肽也是機(jī)體吸收氨基酸的重要形式。人和動(dòng)物腸道吸收蛋白質(zhì)的主要路徑是小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（Oligopeptide transporter，PepT1），其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的能力要高于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[5-7]。PepT1 的底物為二肽或三肽，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力與肽段的帶電性、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量及疏水性有關(guān)[8]，因此蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物性質(zhì)的差異也影響其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。

本研究圍繞磷酸化和糖基化大豆分離蛋白體外胃、腸道消化產(chǎn)物的性質(zhì)展開(kāi)研究，分析酶解物的分子質(zhì)量、帶電性、疏水性和氨基酸組成等指標(biāo)。采用體外結(jié)腸腺癌單層細(xì)胞（Caco-2）模型研究改性大豆蛋白酶解物腸道細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，明確糖基化和磷酸化對(duì)大豆蛋白體外消化性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕，山松生物制品有限公司；胃蛋白酶（P7000）、胰酶Pancreatin（P1750），Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（1100）、色譜柱【分析柱，ZORBAX SB-C18（7.8 mm×300 mm）】，美國(guó)Agilent 公司；千分之一電子天平（GF-300），日本ND公司；熒光光譜儀（LS-55），美國(guó)Perkin Elmer 公司；pH 計(jì)（PP-25-P11），Sartorius 公司；水浴恒溫磁力攪拌器（SHJ-A），金壇市華峰儀器公司；冷凍干燥機(jī)（FD-1），北京博醫(yī)康技術(shù)公司；離心機(jī)（LXJ-I1B），上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Spectrum SP-2100UV），上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備 將低溫脫脂豆粕與水以1∶15 比例混合，以6.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫下提取1 h 后，離心（4 000×g，30 min）。取上清以6.0 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至4.5，靜置30 min 后，離心（4 000×g，20 min），去除上清液，沉淀以蒸餾水洗2 次，將沉淀復(fù)溶后再以NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.0，注入透析袋，于蒸餾水中透析48 h，除去鹽離子，冷凍干燥，得大豆分離蛋白[9]，用于制備改性大豆分離蛋白。取經(jīng)透析的大豆分離蛋白溶液，于沸水浴中90 ℃熱處理10 min，使其胰蛋白酶抑制劑失活。冷凍干燥，得對(duì)照組大豆分離蛋白（Soybean protein isolate），記為SPI。

用蒸餾水將未經(jīng)熱處理的大豆分離蛋白復(fù)溶并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，進(jìn)行磷酸化和糖基化改性。磷酸化改性條件為：將大豆分離蛋白溶液pH 值調(diào)至8.0，分別添加2%，3%，5%的三聚磷酸鈉（Sodium tripolyphosphate，STP），45 ℃攪拌4 h，調(diào)pH 值至4.0，離心（2 000×g，10 min），去除上清液，沉淀以蒸餾水洗2 次，取沉淀，回調(diào)pH 值至7.0。所得溶液注入透析袋，于蒸餾水中透析48 h，除去未反應(yīng)的磷酸根及鹽離子，沸水浴90 ℃熱處理10 min，冷凍干燥，得磷酸化大豆分離蛋白（P2-SPI，P3-SPI，P5-SPI）。糖基化改性條件為：葡萄糖（Glucose，G）/葡聚糖（Dextran，D，10 ku）：SPI = 1∶1（m/m），于100 ℃加熱反應(yīng)1 h 后調(diào)pH值至4.5，離心（2 000×g，10 min），去除上清液，沉淀以蒸餾水洗2 次，取沉淀，回調(diào)pH 值至7.0。所得溶液注入透析袋，于蒸餾水中透析48 h，除去未反應(yīng)的葡萄糖和葡聚糖分子以及鹽離子，沸水浴90 ℃熱處理10 min，冷凍干燥，得糖基化大豆分離蛋白（G-SPI，D-SPI）。

1.3.2 改性大豆蛋白胃、腸道體外消化 根據(jù)Marambe 等[10]的方法略作改動(dòng)。稱(chēng)取一定量的胃蛋白酶，用pH 2.0 的0.2% NaCl 溶液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的胃蛋白酶溶液。稱(chēng)取一定量的胰酶，用pH 7.0 的0.68% KH2PO4和0.062% NaOH 混合溶液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%胰酶溶液。采用Folin-酚法測(cè)定樣品SPI、P2-SPI、P3-SPI、P5-SPI、GSPI，D-SPI 的蛋白含量，將樣品蛋白含量調(diào)整為20 mg/mL，并將樣品溶液的pH 值調(diào)至2.0，在37℃水浴中平衡10 min，加入胃蛋白酶溶液，使得胃蛋白酶在樣品中的最終濃度為200 U/mg 蛋白，于37 ℃水浴消化60 min。胃酶消化結(jié)束后，將各樣品pH 值調(diào)至7.0，在37 ℃水浴中平衡10 min，加入胰酶，使終濃度為0.4 × USP/mg 蛋白，在37 ℃條件下進(jìn)一步消化120 min，沸水浴中加熱至90 ℃保持10 min，冷凍干燥后得到相應(yīng)的SPI 消化產(chǎn)物，分別記為E-SPI、E-P2SPI、E-P3SPI、E-P5SPI，E-GSPI 和E-DSPI。

1.3.3 改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物分子質(zhì)量 采用體積排阻高效液相色譜法（Size high perform liquid chromatography，SE-HPLC）分析胃、腸道酶解物的分子質(zhì)量。稱(chēng)取一定量的待測(cè)樣品，用pH 7.4 的0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液，調(diào)整樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL，用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。色譜條件是：Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Protein Pak 60 凝膠色譜柱（waters，分離范圍1～20 ku）；檢測(cè)溫度27 ℃；流動(dòng)相：pH 7.4 的0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；流速0.5 mL/min；上樣量20 μL。分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：AB2-95（3 313 u）、AB2-81（5 856 u）、AB2-80（7 823 u）、蛋清溶菌酶（14 400 u）、胰蛋白酶抑制劑（20 100 u），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與保留時(shí)間作回歸分析，獲得的回歸方程為T(mén)=25.8677-3.2830 lg MW（R2=0.9943，P＜0.05），式中，MW 為分子質(zhì)量（u），T 為保留時(shí)間（min）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與保留時(shí)間之間的回歸方程計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

1.3.4 改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物電荷分布

1）陽(yáng)離子交換層析：SP Sephadex C25 陽(yáng)離子交換柱（Φ2.6 cm × 20 cm）用pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液平衡，流速為2.0 mL/min。將消化產(chǎn)物復(fù)溶于pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液中，制備樣品質(zhì)量濃度為400 mg/mL 的溶液，之后用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾。取1.0 mL 濾液進(jìn)樣，在0～120 min 內(nèi)，采用pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液溶液洗脫分離未吸附的肽組分；120～300 min內(nèi)，采用含有0.5 mol/L NaCl 的pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，運(yùn)用系統(tǒng)自帶的HD-A 色譜處理記錄系統(tǒng)記錄圖譜的變化。

2）陰離子交換層析：DEAE-Sepharose 陰離子交換柱（Φ2.6 cm×20 cm）用0.02 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液平衡，流速為2.0 mL/min。將消化產(chǎn)物復(fù)溶于pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液中，制備成樣品質(zhì)量濃度為400 mg/mL 的溶液，之后用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾。取1.0 mL 濾液進(jìn)樣，在0～120 min 內(nèi)，采用pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液溶液洗脫分離未吸附的肽組分；120～180 min內(nèi)，采用含有0.5 mol/L NaCl 的pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液洗脫；180～240 min 內(nèi)，采用含有1.0 mol/L NaCl 的pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液洗脫；240～360 min 內(nèi)，采用含有2.0 mol/L NaCl的pH 7.0 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，運(yùn)用系統(tǒng)自帶的HD-A 色譜處理記錄系統(tǒng)記錄圖譜的變化。

1.3.5 改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物表面疏水性指數(shù) 參照Haskard 等[11]的檢測(cè)方法并略有改進(jìn)。表面疏水性指數(shù)（S0）采用ANS-熒光探針?lè)y(cè)定。用pH 7.0 的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)苽涓男源蠖沟鞍酌附馕镔|(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的樣品稀釋液。ANS-熒光探針染液（1.25 mmol/L）采用相同的緩沖液配制。吸取0.5 mL ANS 染液與4.5 mL 樣品稀釋液混合均勻，避光靜置2 h。將混合液在波長(zhǎng)375 nm 處激發(fā)，用熒光光譜儀掃描波長(zhǎng)390～470 nm 范圍的熒光發(fā)射光譜，狹縫寬10 nm，掃描速率200 nm/min。以最大熒強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，利用線性回歸求回歸曲線的斜率，即表面疏水性指數(shù)（S0）。

1.3.6 改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物氨基酸組成分析 大豆蛋白消化產(chǎn)物氨基酸組成分析采用HPLC-異硫氰酸苯酯柱前衍生法。所有樣品采用6 mol/L HCl 進(jìn)行全水解。采用0.1 mol/L HCl 溶液配置2 mg/mL 的全水解樣品，取100 μL 異硫氰酸苯酯的乙腈溶液和100 μL 三乙胺（0.1 mol/L HCl 溶解），與200 μL 全水解復(fù)溶樣品混合，在黑暗條件下常溫衍生反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入400 μL 正己烷，振蕩均勻，靜止10 min，吸取下層液體，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC 分析。

HPLC 洗脫程序：Venusil AA 氨基酸分析專(zhuān)用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：pH 8.2的10 mmol/L 磷酸緩沖液；流動(dòng)相B：80% 乙腈。流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.7 Caco-2 細(xì)胞單層模型的建立 采用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Caco-2 細(xì)胞。培養(yǎng)液為含有10%的胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)），1%非必需氨基酸（體積分?jǐn)?shù)），100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素的高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37 ℃，含5% CO2，相對(duì)濕度90%，Caco-2 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中分布達(dá)80%時(shí)，用含有0.5% EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，然后以4×105～5×105細(xì)胞/mL 濃度接種于6 孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的上側(cè)。每隔2 d 更換1 次細(xì)胞培養(yǎng)液。

Caco-2 單層細(xì)胞培養(yǎng)到14 d，用Hank's 平衡緩沖液（Hank's Balanced Salt Solution，HBSS）清洗Caco-2 細(xì)胞2～3 次，然后在單層細(xì)胞上側(cè)（AP）和下側(cè)（BL）分別加入1.5 mL 和2.7 mL HBSS 溶液，在37 ℃平衡30 min，移除AP 側(cè)的HBSS 溶液，加入1.5 mL 不同改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物樣品，將加入樣品的Transwell 培養(yǎng)板在37 ℃下吸收轉(zhuǎn)運(yùn)2 h，收集下側(cè)的溶液進(jìn)行微量氨基酸組成分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 的軟件作圖，采用SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析，得到的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以方差分析ANOVA 來(lái)檢測(cè)平均值之間的差異，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量

采用體積排阻色譜法分析不同改性處理的大豆蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果見(jiàn)表1。不同大豆蛋白消化產(chǎn)物中，分子質(zhì)量低于1 ku 的肽段所占比例最大。同時(shí)，改性使得大豆分離蛋白的消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布發(fā)生明顯變化，即，磷酸化大豆分離蛋白消化產(chǎn)物和糖基化大豆分離蛋白消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量低于1 ku 的肽段所占比例與對(duì)照【未改性的大豆蛋白酶解物（E-SPI）】相比均升高，說(shuō)明兩種改性方式均提高了小肽產(chǎn)量。由于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PepT1）轉(zhuǎn)運(yùn)底物主要是二肽和三肽（分子質(zhì)量低于1 ku），因此，推測(cè)兩種改性均有利于大豆蛋白酶解物的吸收。

表1 不同SPI 體外消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of different SPI hydrolysates by in vitro digestion

2.2 消化產(chǎn)物的電荷分布

蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物在體內(nèi)吸收的過(guò)程中，消化產(chǎn)物的帶電情況影響其與PepT1 的相互作用，進(jìn)而決定了其被吸收的情況[12]。

本研究分別采用陽(yáng)離子交換柱（SPSephadex）和陰離子交換柱（DEAE-Sepharose）探究不同電荷的消化產(chǎn)物組分所占比例，得到如圖1所示的兩個(gè)洗脫色譜圖。圖1a 為陽(yáng)離子交換柱，陽(yáng)離子交換介質(zhì)結(jié)合溶液中帶正電荷的基團(tuán)，帶負(fù)電及不帶電荷的基團(tuán)不被結(jié)合而最先被洗脫，隨著洗脫液中陽(yáng)離子濃度的提高，結(jié)合在交換填料上的正電荷基團(tuán)被洗脫液中陽(yáng)離子交換而洗脫下來(lái)。在0～120 min 內(nèi)，被洗脫出的F1 峰和F2 峰為非正電荷組分（即帶負(fù)電荷或電中性組分），在120～360 min 內(nèi)，洗脫出的F3 峰為帶正電荷的組分。類(lèi)似地，圖1b 為陰離子交換柱，陰離子交換介質(zhì)則相反，結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的基團(tuán)，最先洗脫出來(lái)的是帶正電和不帶電荷的基團(tuán)，隨著洗脫液陰離子濃度的增加，帶負(fù)電荷組分逐漸被洗脫出來(lái)。在0～120 min 內(nèi)，被洗脫出的F′1 峰表示非負(fù)電荷組分（即帶正電荷或不帶電組分），在120～360 min 內(nèi)，隨著洗脫液中氯離子濃度從0.5 mol/L增加到2.0 mol/L，被洗脫出的組分F′2、F′3、F′4 和F′5 均為帶負(fù)電荷的組分，且負(fù)電荷量依次增加。

圖1 磷酸化和糖基化改性大豆蛋白體外消化物的離子交換色譜圖Fig.1 Ion exchange chromatography of SPI hydrolysates by in vitro digestion

不同改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物電荷組分所占比例見(jiàn)表2。在陽(yáng)離子交換層析過(guò)程中，與對(duì)照（E-SPI）相比，E-P2SPI 中正電荷組分（F3）比例提高，而隨著磷酸化程度的提高，E-P3SPI 和EP5SPI 的正電荷組分逐漸下降，與E-SPI 相比分別下降了6.58%和8.28%。低磷酸化改性大豆蛋白酶解物比未改性大豆蛋白酶解物正電荷組分高，而隨著磷酸化程度的提高，正電荷組分減少。葡萄糖糖基化消化產(chǎn)物（E-GSPI）和葡聚糖糖基化消化產(chǎn)物（E-DSPI）中F3 所占比例顯著高于E-SPI，即糖基化改性大豆蛋白酶解物中正電荷組分比例顯著高于未改性大豆蛋白酶解物。

接著，采用陰離子交換層析分析不同改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物的電荷分布情況，發(fā)現(xiàn)不同改性的大豆蛋白體外消化產(chǎn)物（E-P2SPI、EP3SPI、E-P5SPI、E-GSPI、E-DSPI）中帶負(fù)電荷的組分（F′2+F′3+F′4+F′5）顯著高于對(duì)照（E-SPI）。

有研究表明，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1 更易與中性不帶電荷的小肽相結(jié)合[12]。根據(jù)陰陽(yáng)離子交換原理，進(jìn)一步分析了大豆蛋白體外消化產(chǎn)物中電中性組分的分布情況。表2 中，陽(yáng)離子交換柱（SPSephadex C25）中F1+F2 組分（非正電荷組分）與陰離子交換柱（DEAE-Sepharose）中F′2+F′3+F′4+F′5 組分（負(fù)電荷）的差值，即電中性組分（I）。同時(shí)，陰離子交換柱（DEAE-Sepharose）中F′1（非負(fù)電荷組分）與陽(yáng)離子交換柱（SP-Sephadex C25）中F3 組分（正電荷）的差值，即電中性組分（II）。如表2所示，采用兩種計(jì)算方法得到的陽(yáng)離子交換柱（SP-Sephadex C25）中電中性組分（I）和II 電中性組分（II）差異不顯著，說(shuō)明該方法的可行性。由表2 可看出，所有大豆蛋白體外消化產(chǎn)物樣品的中性不帶電荷的組分所占比例均最大。低水平磷酸化SPI 消化產(chǎn)物（E-P2SPI）較E-SPI 而言，電中性組分的比例顯著降低，然而，隨磷酸化程度提高，電中性組分所占比例逐漸增加，然而，始終低于E-SPI。葡萄糖糖基化SPI 消化產(chǎn)物（E-GSPI）電中性組分所占比例低于對(duì)照，而葡聚糖糖基化SPI消化產(chǎn)物（E-DSPI）電中性組分所占比例高于對(duì)照。有研究表明，PepT1 傾向于優(yōu)先與中性不帶電荷組分結(jié)合[12]。分析改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物帶電性的性質(zhì)，磷酸化改性可能會(huì)抑制大豆蛋白胃、腸道酶解物的轉(zhuǎn)運(yùn)，且隨著磷酸化程度的提高，磷酸化樣品與小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的親和力逐漸提高，而其親和力仍低于對(duì)照。糖基化改性大豆蛋白體外消化產(chǎn)物呈現(xiàn)的結(jié)果不一致，葡聚糖E-SPI大豆蛋白體外消化產(chǎn)物（E-DSPI）與PepT1 親和力高于未改性的樣品（E-SPI），而葡萄糖糖基化產(chǎn)物E-GSPI 低于E-SPI，這可能與參與改性的兩種糖的分子質(zhì)量不同有關(guān)。

表2 陽(yáng)離子和陰離子交換柱層析分離的不同樣品的不同電荷組分比例Table 2 Different charge component ratio of E-SPIs separated by SP-Sephadex and DEAE-Sepharose

2.3 消化產(chǎn)物表面疏水性指數(shù)（S0）

蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物性質(zhì)中，除分子質(zhì)量和電荷外，疏水性也影響酶解物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。采用ANS熒光探針?lè)y(cè)得不同改性大豆蛋白消化產(chǎn)物表面疏水性如圖2所示。未改性大豆蛋白（E-SPI）和磷酸化大豆蛋白（E-P2SPI、E-P3SPI、E-P5SPI）胃、腸道體外消化產(chǎn)物的表面疏水性指數(shù)分別為11.579，11.285，11.470和12.075。低磷酸化程度大豆蛋白消化產(chǎn)物（E-P2SPI、E-P3SPI）與E-SPI 相比，差異不具有顯著性，而高磷酸化程度（EP5SPI）消化產(chǎn)物表面疏水性顯著高于E-SPI（P＜0.05），且磷酸化大豆分離蛋白消化產(chǎn)物的表面疏水性指數(shù)隨磷酸化程度的增加，呈升高趨勢(shì)。EP2SPI 中的小分子質(zhì)量組分所占比例明顯高于對(duì)照E-SPI（表1）。在胃、腸道消化過(guò)程中，隨著酶解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)分子鏈不斷縮短，親水基團(tuán)暴露的越來(lái)越多，使溶解性越來(lái)越好。低分子質(zhì)量組分含量高的消化產(chǎn)物親水性提高，相應(yīng)的疏水性下降，這是E-P2SPI 的表面疏水性指數(shù)略低于對(duì)照組（E-SPI）的原因，但兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。然而，隨著磷酸化程度的提高，磷酸化引入的靜電斥力作用相對(duì)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致消化產(chǎn)物內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露的更多[13]，因此，消化產(chǎn)物表面疏水性呈現(xiàn)隨磷酸化程度的提高而增高的趨勢(shì)（E-P5SPI 顯著高于E-P2SPI 和E-P3SPI，P ＜0.05）。

圖2 磷酸化和酰基化大豆蛋白體外消化物的表面疏水性指數(shù)（S0）Fig.2 Surface hydrophobicity（S0）of different SPI hydrolysates by in vitro digestion

糖基化大豆蛋白（E-GSPI 和E-DSPI）胃、腸道體外消化產(chǎn)物的表面疏水性指數(shù)分別為9.087和9.820，與E-SPI（11.579）相比，糖基化大豆分離蛋白消化產(chǎn)物表面疏水性指數(shù)均顯著降低，可能由于糖基化引入大量親水性羥基，經(jīng)胃、腸道消化后暴露更加徹底，從而導(dǎo)致其消化產(chǎn)物疏水性降低。E-GSPI 疏水性指數(shù)較E-SPI 降低了21%，EDSPI 降低了14%，E-DSPI 的表面疏水性指數(shù)降低程度高于E-GSPI，可能是由葡聚糖引入的空間位阻作用所致。

結(jié)合Nielsen 等[14]的研究，PepT1 易與表面疏水性強(qiáng)的小肽相結(jié)合，磷酸化SPI 的消化產(chǎn)物尤其是E-P5SPI 更易與PepT1 結(jié)合，從而更易被吸收。而糖基化SPI 消化產(chǎn)物與E-SPI 相比，不易與PepT1 結(jié)合。

2.4 消化產(chǎn)物氨基酸組成

蛋白質(zhì)在胃、腸道消化過(guò)程中釋放的氨基酸種類(lèi)及數(shù)量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[15]。經(jīng)不同改性處理的SPI 對(duì)應(yīng)消化產(chǎn)物的氨基酸組成情況如表3所示。

表3 Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)前不同SPI 消化產(chǎn)物的氨基酸組成情況Table 3 Amino acid composition of different SPI hydrolysates before Caco-2 cells transportation

（續(xù)表3）

對(duì)總氨基酸含量而言，體外消化后磷酸化改性大豆蛋白體外消化酶解物均低于未改性樣品（E-SPI），E-P2SPI 的總氨基酸含量下降最多，約6.9%。糖基化改性中葡萄糖糖基化大豆蛋白的體外酶解物（G-DSPI）總氨基酸略高于E-SPI，而葡聚糖糖基化改性蛋白制得的消化產(chǎn)物（E-DSPI）下降了10.7%。各種SPI 對(duì)應(yīng)的必需氨基酸變化趨勢(shì)與總氨基酸的趨勢(shì)大致相同。同樣，與未改性樣品（E-SPI）相比，改性樣品中必需氨基酸含量下降最顯著的是E-DSPI，下降約11.7%。大豆蛋白的限制性氨基酸為Met 和Cys。與E-SPI 相比，各種改性大豆蛋白體外酶解物的Met 均有所下降，其中E-DSPI 的Met 含量與E-SPI 相比差異最大，降低約58.0%。對(duì)Cys 而言，E-DSPI 較E-SPI下降了19.9%，而其它改性蛋白差異不明顯。

對(duì)于其它氨基酸，磷酸化和糖基化樣品的Lys、Arg、Ser 和Thr 含量較E-SPI 均有不同程度的下降，可能是由于這些氨基酸參與了改性反應(yīng)，從而降低其可檢測(cè)量。田少君等[16]證實(shí)三氯氧磷與大豆分離蛋白反應(yīng)的實(shí)質(zhì)主要是Lys 及Arg 殘基進(jìn)行氨基磷酯化反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白磷酸化位點(diǎn)在羥基氨基酸上[17]。Sung 等[18]則認(rèn)為，三聚磷酸鈉磷酸化的主要位點(diǎn)是Ser 和Lys。關(guān)于糖基化位點(diǎn)，Guerra 等[19]報(bào)道糖基化主要發(fā)生在Lys的ε-NH2上，Lys 和還原糖反應(yīng)形成復(fù)合物，使得Lys 不能被消化酶識(shí)別，從而降低了有效Lys 的含量。

進(jìn)一步分析各種蛋白質(zhì)體外消化酶解物中的非極性疏水氨基酸（Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Met）、極性中性氨基酸（Thr，Ser，Gly，Cys，，Tyr）、酸性氨基酸（Asp，Glu）和堿性氨基（Lys，His，Arg）酸所占比例，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于未改性SPI，各種氨基酸中非極性疏水性氨基酸所占比例最高，其次是酸性氨基酸，極性中性氨基酸和堿性氨基酸比例相近。磷酸化改性SPI 的各種氨基酸比例與SPI相比變化不明顯。而糖基化改性SPI，非極性疏水性氨基酸和極性中性氨基酸比例下降，酸性氨基酸比例略有升高。

表4 Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)前不同SPI 消化產(chǎn)物的氨基酸分類(lèi)Table 4 Amino acid category in different SPI hydrolysates before Caco-2 cells transportation

2.5 消化產(chǎn)物經(jīng)Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后的氨基酸組成分析

Caco-2 細(xì)胞是人體的結(jié)腸腺癌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)分化具有腸吸收細(xì)胞的特點(diǎn)，且能表達(dá)PepT1 轉(zhuǎn)運(yùn)載體，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和肽吸收情況的評(píng)價(jià)[21]。本研究在評(píng)估了不同改性處理大豆蛋白體外消化酶解物的性質(zhì)基礎(chǔ)上，采用Caco-2 單層細(xì)胞模型進(jìn)一步考察糖基化和磷酸化改性對(duì)大豆蛋白體外消化和吸收的影響。不同改性SPI 對(duì)應(yīng)消化產(chǎn)物在Caco-2 單層細(xì)胞模型轉(zhuǎn)運(yùn)后的氨基酸組成情況見(jiàn)表5。

表5 Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后不同SPI 消化產(chǎn)物的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of different SPI hydrolysates after Caco-2 cells transportation

由表3 可知，與對(duì)照樣品（E-SPI）相比，磷酸化和糖基化改性大豆蛋白體外消化物轉(zhuǎn)運(yùn)的肽段總氨基酸和必需氨基酸仍呈下降趨勢(shì)，而下降程度均低于各樣品所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)前總氨基酸及必需氨基酸的下降程度。其中，E-DSPI 經(jīng)Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后的總氨基酸和必需氨基酸與對(duì)照相比下降程度遠(yuǎn)低于E-DSPI 未轉(zhuǎn)運(yùn)前，對(duì)于大豆蛋白的限制性氨基酸Met 和Cys，E-DSPI 中Met 含量與E-SPI 相比下降了58.0%，然而Caco-2 腸道單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后，E-DSPI 的Met 含量較轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)照下降了5.9%。對(duì)Cys 而言，E-DSPI 較E-SPI 下降19.9%，轉(zhuǎn)運(yùn)后E-DSPI 中Cys 含量反而高于ESPI 中Cys 含量，這些結(jié)果說(shuō)明腸道細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)可緩解改性造成的大豆蛋白酶解物氨基酸含量下降或損失的現(xiàn)象。

對(duì)Caco-2 細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)后，各種改性蛋白質(zhì)的非極性疏水氨基酸、極性中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸所占比例進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。對(duì)于對(duì)照E-SPI，轉(zhuǎn)運(yùn)后疏水性氨基酸所占比例仍高于極性中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸。同時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)后的疏水氨基酸所占比例明顯高于轉(zhuǎn)運(yùn)前疏水氨基酸所占比例（表4）。也就是說(shuō)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，疏水性氨基酸更易被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究報(bào)道，PepT1 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體上參與二肽和三肽結(jié)合的位點(diǎn)為保守的疏水氨基酸[7]。此外，可以看到極性和中性氨基酸比例顯著提高，而酸性氨基酸比例明顯下降，導(dǎo)致極性和中性氨基酸所占比例高于酸性氨基酸和堿性氨基酸，這與Kottra 等[12]的報(bào)道一致，即電中性小肽的吸收效果最好。表2 結(jié)果也表明，大豆蛋白的體外酶解物中攜帶電中性電荷的肽段比例最高，決定了經(jīng)Caco-2 細(xì)胞吸收后極性中性氨基酸比例明顯提高。對(duì)于磷酸化和糖基化的大豆蛋白樣品，不同種類(lèi)氨基酸比例與對(duì)照大致相同。其中，磷酸化大豆蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的疏水性氨基酸比例明顯高于對(duì)照SPI 和糖基化大豆蛋白，Caco-2 細(xì)胞中的PepT1 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體易與表面疏水性強(qiáng)的小肽結(jié)合[14]。圖2 顯示磷酸化大豆蛋白體外酶解物的表面疏水性（尤其是E-P5SPI）高于對(duì)照和糖基化大豆蛋白，這可能是導(dǎo)致其疏水性氨基酸比例提高的原因。對(duì)于糖基化大豆蛋白（尤其是E-DSPI），其轉(zhuǎn)運(yùn)的非極性中性氨基酸的比例高于對(duì)照。研究表明，PepT1對(duì)底物親和力順序?yàn)橹行噪模娟?yáng)離子肽＞陰離子肽[12]。表2 結(jié)果顯示，E-DSPI 的中性電荷肽含量明顯高于對(duì)照，進(jìn)一步解釋了這一現(xiàn)象。

表6 Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后不同SPI 消化產(chǎn)物的氨基酸分類(lèi)Table 6 Amino acid category in different SPI hydrolysates after Caco-2 cells transportation

可見(jiàn)，影響蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物吸收的因素很多，除與酶解物氨基酸組成有關(guān)外，還受消化產(chǎn)物性質(zhì)，如分子質(zhì)量、電荷分布及表面疏水性等的影響。消化產(chǎn)物與腸吸收細(xì)胞小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相互作用決定了肽段和氨基酸被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的程度。與未改性大豆蛋白相比，磷酸化和糖基化改性大豆蛋白消化產(chǎn)物從氨基酸組成上看，均顯著降低了蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)性，然而經(jīng)Caco-2 單層細(xì)胞模型轉(zhuǎn)運(yùn)后，這種現(xiàn)象明顯緩解，尤其是必需氨基酸含量。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)底物的選擇性，傾向于對(duì)電中性、低分子質(zhì)量、疏水性強(qiáng)肽段的吸收，緩解了磷酸化和糖基化改性降低大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)性的影響。

3 結(jié)論

磷酸化和糖基化改性改變了大豆蛋白體外消化酶解物的性質(zhì)。從氨基酸組成上看，總氨基酸、必需氨基酸和大豆蛋白的限制性氨基酸（Met 和Cys）含量降低。同時(shí)，磷酸化和糖基化改性后大豆蛋白體外消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量均下降。磷酸化改性降低了消化產(chǎn)物的電中性肽段含量，糖基化改性（E-DSPI）則相反。磷酸化改性（E-P5SPI）提高了消化產(chǎn)物的疏水性，而糖基化改性則顯著降低了肽段的表面疏水性指數(shù)。經(jīng)腸細(xì)胞Caco-2 轉(zhuǎn)運(yùn)后，在消化產(chǎn)物分子質(zhì)量、帶電性及疏水性等因素的共同作用下，磷酸化和糖基化改性造成的大豆蛋白氨基酸損失降低，蛋白質(zhì)消化酶解物性質(zhì)決定其被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的情況。