消銀解毒飲通過cdc7抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖作用的動物實驗研究

韓 露 周 揚(yáng) 段行武 陳 兵 方如男 李建紅

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其特征性病理改變?yōu)槌掷m(xù)性炎癥以及角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)增殖失控和分化障礙[1]。銀屑病皮損組織中KCs的增殖速度是正常表皮的2倍，而其細(xì)胞周期縮短到正常周期的1/8[2]，可見KCs的異常增殖與細(xì)胞周期紊亂密切相關(guān)。細(xì)胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein，cdc)7是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，TAK-931則是一種cdc7選擇性抑制劑，具有顯著的抗增殖活性[3]。盡管目前沒有cdc7與銀屑病發(fā)病的相關(guān)報道，但有皮膚腫瘤方面的研究顯示cdc7在黑素瘤組織中高表達(dá)，而TAK-931可有效抑制黑素瘤進(jìn)展[4]，提示我們cdc7在皮膚組織中發(fā)揮重要作用，且與表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖密切相關(guān)。銀屑病是KCs過度增生性疾病，我們先期的預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn)，在銀屑病體內(nèi)外模型中cdc7呈過度表達(dá)，提示 cdc7可能與銀屑病 KCs 異常增殖之間有密切聯(lián)系。

消銀解毒飲根據(jù)東直門醫(yī)院金起鳳教授創(chuàng)立的經(jīng)驗方“消銀解毒湯”研制，臨床應(yīng)用多年，治療銀屑病血熱證療效確切[5]。先期研究顯示消銀解毒飲可以通過抑制KCs增殖治療銀屑病[6,7]，然而其抑制KCs增殖的作用是否通過對細(xì)胞周期的調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。本實驗擬建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，觀測用藥前后小鼠銀屑病皮損表現(xiàn)、表皮病理改變、皮膚組織cdc7表達(dá)情況，從動物實驗水平探討消銀解毒飲通過cdc7抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性BALB/c小鼠20只，8周齡，體重20 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼) 2020-0001。

1.2 藥物 院內(nèi)制劑消銀解毒飲(水牛角30 g，生地15 g，丹皮12 g，土茯苓30 g，苦參10 g，紫草15 g，生甘草6 g等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院顆粒藥房提供。按照小鼠劑量(20 g體重)=9.1×成人劑量(70 kg體重)，得到小鼠灌胃劑量為23.4 g/kg，雙蒸水溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 cdc7抑制劑TAK-931(MCE，貨號：HY-100888)；5%咪喹莫特乳膏(明欣藥業(yè)，貨號：74969)；異氟烷(瑞沃德，貨號：217180101)；蘇木素(Sigma，貨號：H9627)；伊紅Y(水溶性)(國藥集團(tuán)，貨號：71014544)；無水乙醇(國藥集團(tuán)，貨號：10009218)；二甲苯(國藥集團(tuán)，貨號：10023418)；包埋石蠟(國藥集團(tuán)，貨號：69019361)；中性樹膠(國藥集團(tuán)，貨號：10004160)；正常山羊血清(博士德生物，貨號：15GO6AC9)；Dako免疫組化試劑盒(安捷倫，貨號：K5007)；重組Anti-CDC7抗體(abcam，貨號：ab229187)。

1.4 儀器 病理切片機(jī)(德國Leica，型號：RM 2016)；脫水機(jī)(武漢俊杰，型號：JT-12J)；組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰，型號：JK-6)；顯微鏡(奧林巴斯，型號：BX53)。

1.5 分組及造模

1.5.1 建立動物模型[8，9]將20只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為4組，每組5只：①對照組；②銀屑病模型組；③消銀解毒飲組；④TAK-931組。實驗前所有小鼠予異氟烷吸入麻醉，除去背部毛發(fā)，形成約2 cm×3 cm皮膚暴露區(qū)域。②③④組每只小鼠每日涂抹含5% IMQ的膏霜50 mg，①組小鼠只進(jìn)行等量凡士林涂抹處理，連續(xù)涂抹5天。

1.5.2 實驗給藥 ①②組小鼠蒸餾水灌胃；③組每天進(jìn)行消銀解毒飲灌胃處理(每次23.4 g/kg)；④組每天進(jìn)行TAK-931灌胃處理(每次2 mg/kg)。所有動物給藥容量是每次10 mL/kg，每天2次，造模當(dāng)天開始給藥，連續(xù)5天。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 小鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評估 第1～5天涂抹IMQ前及第6天，每天對小鼠背部皮膚暴露區(qū)域進(jìn)行單獨(dú)拍照處理，動態(tài)觀察皮損進(jìn)展情況，依據(jù)銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評價辦法[10]，對小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(無)；1分(輕度)；2分(中度)；3分(重度)；4分(極重度)。將三者相加得到總積分，對各組小鼠的總積分取均值后繪制趨勢圖。

1.6.2 HE染色觀察小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)改變 于造模第6天，處死小鼠取其背部皮膚組織，經(jīng)脫水、透明處理后，進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。切片脫蠟，入蘇木素染液染色5 min，沖洗后入1%水溶性伊紅染液染色5 min，以中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像，觀察各組小鼠皮膚組織病理學(xué)變化，并采用ImageJ軟件測量表皮厚度。

1.6.3 免疫組化檢測小鼠皮膚組織中cdc7表達(dá) 皮膚組織切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，滴加3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以正常山羊血清封閉30 min，cdc7抗體(1∶100)4℃孵育過夜，酶標(biāo)二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后以中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像，檢測各組小鼠皮膚組織cdc7表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，PASI評分采用秩和檢驗(Kruskal-wallis)進(jìn)行組間比較，表皮厚度、cdc7陽性細(xì)胞計數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚的影響 從每日皮損變化觀察得到，對照組小鼠皮膚無紅斑、無鱗屑、無增厚改變；造模后小鼠皮膚逐漸出現(xiàn)紅斑，且皮膚不斷增厚，第3天出現(xiàn)鱗屑表征，第6天時，背部皮膚紅斑明顯，布滿層狀鱗屑，易脫落，皮膚高度增厚；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損進(jìn)展較慢，鱗屑明顯減少，紅斑面積較小、顏色較淡，皮損肥厚程度不明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠背部皮損表現(xiàn)

PASI評分結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠第2天起即有皮膚增厚表現(xiàn)，隨抹藥天數(shù)的增加，總評分呈上升趨勢，表明皮損不斷加重，其中第2～3天及第4～5天評分上升幅度最大；與模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組總評分明顯減低，增高速度緩慢，表明消銀解毒飲組與TAK-931組皮損進(jìn)展較慢，紅斑、鱗屑、皮損增厚程度較輕，見圖2。

圖2 各組小鼠皮損PASI評分

2.2 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚組織形態(tài)學(xué)影響 HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠表皮層薄，無增厚改變，細(xì)胞浸潤少；銀屑病模型組小鼠表皮增生明顯，同時存在角化過度與角化不全，棘細(xì)胞層增厚，角質(zhì)層可見Munro微膿腫，真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損區(qū)域表皮增生較輕，真皮層炎性細(xì)胞數(shù)目較少，見圖3。

3a：對照組；3b銀屑病模型組；3c消銀解毒飲組；3d：TAK-931組；黑色箭頭：表皮增生；藍(lán)色箭頭：炎性細(xì)胞浸潤(HE，×200)

使用ImageJ軟件測量HE染色后各組表皮厚度，銀屑病模型組明顯較對照組表皮增厚(P<0.01)，消銀解毒飲組(P<0.01)和TAK-931組(P<0.05)表皮增厚程度均低于模型組，其中消銀解毒飲組對表皮增生的改善作用更明顯,但二組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

2.3 消銀解毒飲對小鼠銀屑病模型皮膚組織中cdc7表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，對照組表皮較少見cdc7陽性細(xì)胞；與對照組相比，模型組表皮cdc7陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)，主要分布于基底層，棘層亦有分布；消銀解毒飲組表皮cdc7陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖5、6。

5a：對照組；5b：銀屑病模型組；5c：消銀解毒飲組

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

3 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前較為公認(rèn)的發(fā)病模型認(rèn)為，當(dāng)皮膚感染或損傷時，角質(zhì)細(xì)胞釋放抗菌肽并與自身遺傳物質(zhì)相結(jié)合，激活樹突狀細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-23等細(xì)胞因子，介導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化。成熟的Th17細(xì)胞分泌IL-17、IL-22、IL-23等炎性反應(yīng)因子激活KCs的增殖。KCs過度增殖又分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽等物質(zhì)趨化Th17等炎癥細(xì)胞至皮膚，從而形成了促進(jìn)銀屑病發(fā)生發(fā)展的正反饋環(huán)路[11,12]。由此可見，KCs過度增殖在銀屑病的發(fā)生和維持中都起重要作用。

cdc7是細(xì)胞周期中必需的一種激酶，特別調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1/S相變，而G1/S相變是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)。cdc7在與其調(diào)節(jié)亞基DBF4結(jié)合后形成活性激酶復(fù)合體(DBF4-dependent kinase，DDK)，使其下游效應(yīng)分子微小染色體效應(yīng)維持蛋白(mini chromosome maintenance protein，MCM)2-7磷酸化，從而激活解旋酶活性，開啟DNA復(fù)制的第一步[3,13]。而KCs的異常增殖與細(xì)胞周期紊亂密切相關(guān)[2]，依此推測cdc7對細(xì)胞周期DNA復(fù)制起始的調(diào)控可能參與銀屑病KCs異常增殖的病理過程。

在本次研究中，與對照組相比模型組小鼠皮膚經(jīng)IMQ誘導(dǎo)后出現(xiàn)紅斑、鱗屑、皮膚增厚改變，同時HE染色觀察小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠表皮增生明顯，棘細(xì)胞層增厚，真皮層有炎性細(xì)胞浸潤，以上均符合銀屑病臨床及病理表現(xiàn)。在應(yīng)用cdc7抑制劑TAK-931后，對小鼠皮損PASI評分有較為明顯的改善作用，HE染色結(jié)果顯示，TAK-931可以減輕銀屑病模型表皮增生程度，減輕炎癥細(xì)胞浸潤。說明cdc7對細(xì)胞周期的調(diào)控作用可以促進(jìn)銀屑病KCs的異常增殖，通過抑制cdc7可以有效干預(yù)小鼠銀屑病模型進(jìn)展。

我院制劑消銀解毒飲由水牛角、生地、牡丹皮、赤芍、金銀花等藥物組成，有涼血清熱、解毒化斑、泄?jié)裰拱W的作用，臨床研究顯示，其治療銀屑病血熱證的總有效率為91.8%，療效確切[5]。我科前期研究采用藥理血清的方法，以角質(zhì)形成細(xì)胞株 COLO-16為研究對象，觀察消銀解毒飲及拆方后各組藥物血清對KCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)消銀解毒飲可直接抑制KCs過度增殖以及誘導(dǎo)其凋亡，并且可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，從而發(fā)揮對銀屑病的治療作用[6,7,14]。本研究使用消銀解毒飲干預(yù)小鼠銀屑病模型，發(fā)現(xiàn)消銀解毒飲可以明顯改善小鼠皮損PASI評分及組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；免疫組化法檢測結(jié)果顯示，消銀解毒飲可以顯著降低小鼠銀屑病模型表皮cdc7陽性細(xì)胞的水平。

綜上所述，cdc7可以促進(jìn)銀屑病KCs的異常增殖，消銀解毒飲可能通過下調(diào)cdc7表達(dá)，抑制KCs的過度增殖，發(fā)揮對銀屑病的治療作用。然而，本研究尚處于消銀解毒飲通過cdc7抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖研究的初級階段，關(guān)于其作用機(jī)制尤其是具體信號通路的具體調(diào)控過程仍亟待進(jìn)一步闡明。