丹參酮治療雄激素性禿發(fā)大鼠模型的研究

胡嘉元 李 锘 底 君 王思丹 劉青武 陳 靜 楊頂權(quán)

1首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，北京，100010；2中日友好醫(yī)院皮膚與性病科，北京，100029；3太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)皮膚科，北京，100028；4鐘祥市中醫(yī)院皮膚科，湖北鐘祥，431900；5北京中醫(yī)藥大學，北京，100029；6首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京，100010；7浙江省皮膚病醫(yī)院，浙江德清，313200

雄激素性禿發(fā)(androgenetic alopecia, AGA)是臨床上最常見的脫發(fā)性疾病，表現(xiàn)為頭發(fā)密度進行性減少[1]，頭發(fā)生長周期及毛囊微結(jié)構(gòu)的改變[2]，據(jù)統(tǒng)計，我國男性AGA的發(fā)病率高達21.3%，女性發(fā)病率約為6.0%[3,4]。AGA的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前毛發(fā)學界普遍認為此病為雄激素依賴的常染色體顯性遺傳多變性疾病[1]，AGA發(fā)病涉及遺傳易感性、性激素代謝、毛囊微環(huán)境炎癥反應(yīng)及精神因素等多個方面[5]。

雄激素性禿發(fā)的臨床表現(xiàn)以頭發(fā)密度進行性減少為主，同時伴有頭皮脂溢增多、頭屑增多、頭皮瘙癢等癥狀[6]，給患者帶來巨大的身心困擾。目前AGA的臨床治療周期較長，指南中推薦的方法主要為抑制II型5α還原酶、抗雄激素以及外用米諾地爾[7]，治療手段有限。

丹參酮是中藥丹參提取物制備的中成藥，包含隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB以及羥基丹參酮IIA等主要成分，研究顯示其具有調(diào)節(jié)性激素水平、抑制皮脂腺活性、改善微循環(huán)和顯著的抗炎抑菌等作用[8]，臨床上廣泛應(yīng)用于治療皮膚感染、痤瘡等疾病。有研究應(yīng)用丹參酮治療AGA取得了一定療效[9-11]。本研究應(yīng)用DHT皮下注射的方法建立大鼠AGA模型，應(yīng)用丹參酮對AGA模型大鼠進行治療，評價丹參酮治療AGA的療效，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠32只，雄性，體重(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所SPF級實驗動物平臺，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑與主要實驗儀器 二氫睪酮購于美國Sigma公司(批號521-18-6)；藥用玉米油(CAS：8001-30-7)購自北京索萊寶科技有限公司；實驗藥物丹參酮(河北興隆希力藥業(yè)有限公司)、非那雄胺片(杭州默沙東制藥有限公司)均由中日友好醫(yī)院藥學部提供；大鼠雌二醇(E2)ELISA檢測試劑盒、大鼠睪酮(T)ELISA檢測試劑盒、大鼠二氫睪酮(DHT)ELISA檢測試劑盒、大鼠酸性成纖維細胞生長因子(αFGF)ELISA檢測試劑盒、大鼠胰島素樣生長因子(IGF-1)ELISA檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)ELISA檢測試劑盒均購于北京雅安達生物技術(shù)有限公司(YAD)；酶標儀MK3雷勃(THERMO FISHER)；洗板機MK2雷勃(THERMO FISHER)；離心機英泰TG16(長沙英泰儀器有限公司)；恒溫箱DH3600A通利信達(天津市通利信達儀器)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 32只Wistar大鼠以隨機數(shù)字表法分為4組：空白對照組(K組)、二氫睪酮造模組(DHT組)、丹參酮組(D組)及非那雄胺組(F組)各8只。

1.2.2 大鼠模型的建立 將實驗藥物二氫睪酮溶于藥用玉米油中，配制為濃度6 mg/mL的溶液，DHT組、D組、F組大鼠每日給藥，給藥方式：大鼠背部皮下注射；給藥量：5 mg/kg·d，連續(xù)給藥60天；K組大鼠未做處理。各組間大鼠飼養(yǎng)條件、飲食及飲水均無差別。

1.2.3 實驗給藥 將實驗藥物丹參酮溶于生理鹽水中，配制成25 mg/mL溶液，根據(jù)人/大鼠體表面積換算，D組大鼠予0.24 g/kg·d藥量進行灌胃治療，灌胃治療從造模的第二天開始，連續(xù)給藥60天；實驗藥物非那雄胺溶于生理鹽水中，配制成0.012 mg/mL溶液，根據(jù)人/大鼠體表面積換算，F(xiàn)組大鼠予0.12 mg/kg·d藥量進行灌胃治療，灌胃時間與D組一致；其余2組的大鼠每日予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃時間與D組一致。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 一般情況 觀察各組大鼠的精神、活動情況，背部皮下注射區(qū)域的外觀、紅腫程度、毛發(fā)的顏色、光澤度以及質(zhì)地的變化。

1.2.4.2 組織病理學 建模60天之后，對各組大鼠行麻醉處理，大鼠背部皮下注射DHT的區(qū)域(K組大鼠相同部位)脫毛，剪取1.5 cm3的全皮組織，對其中1 cm3的全皮組織予甲醛溶液固定，并行蠟塊包埋制作病理切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察大鼠皮下注射區(qū)域的組織病理學特點，毛囊周圍組織的炎癥情況以及毛囊周期。

1.2.4.3 血清及組織激素與細胞因子水平的檢測 對各組大鼠進行腹主動脈取血，用ELISA法檢測血清中的睪酮(T)、雌二醇(E2)、二氫睪酮(DHT)、酸性成纖維細胞生長因子(αFGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的水平；將剩余的0.5 cm3全皮組織加生理鹽水進行組織勻漿，離心，取上清液，用ELISA法定量檢測組織中上述的激素及細胞因子的水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模開始2周之后，DHT組、D組和F組的大鼠出現(xiàn)不同程度的精神亢奮、情緒躁動等情況，以DHT組大鼠的躁動情況最為明顯，實驗操作過程中出現(xiàn)暴力反抗行為。DHT組、D組和F組的大鼠背部注射區(qū)域皮膚未出現(xiàn)紅腫、滲液、糜爛等異常，大鼠背部毛發(fā)逐漸開始失去光澤，毛色灰黃，毛發(fā)油膩明顯，造模3周之后逐漸出現(xiàn)毛發(fā)脫落，毛發(fā)稀疏、干枯、纖細、質(zhì)脆。觀察結(jié)果提示AGA大鼠模型成功建立(圖1)。

圖1 1a：空白對照組大鼠背部毛發(fā)密集，潔凈且具有光澤；1b：二氫睪酮造模組大鼠背部毛發(fā)油膩，毛色呈灰黃色，毛干質(zhì)脆，部分毛發(fā)脫落；1c：丹參酮組大鼠背部毛發(fā)較二氫睪酮造模組大鼠毛發(fā)密集，質(zhì)硬、且光澤度好；1d:非那雄胺組大鼠背部毛發(fā)較二氫睪酮造模組大鼠毛發(fā)密集，但相比丹參酮組毛發(fā)更為油膩

2.2 大鼠血清及組織激素、細胞因子水平的檢測結(jié)果

2.2.1 血清激素及細胞因子檢測結(jié)果 大鼠血清的激素及細胞因子檢測結(jié)果顯示，D組、F組的血清雌二醇濃度與DHT組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，丹參酮顯著升高AGA模型大鼠血清的雌二醇濃度，D組與F組相比較，非那雄胺升高血清雌二醇的水平略高于丹參酮，但未顯示統(tǒng)計學差異；DHT組與D組、F組的血清DHT濃度比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，丹參酮可顯著降低AGA模型大鼠血清的DHT濃度，其降低AGA模型大鼠血清DHT的程度較非那雄胺更明顯；DHT組的血清TNF-α、TGF-β1濃度明顯高于K組(P<0.05)，丹參酮及非那雄胺均具有輕度降低AGA模型大鼠血清TNF-α、TGF-β1濃度的作用，但并無統(tǒng)計學差異(表1)。

2.2.2 組織激素及細胞因子檢測結(jié)果 大鼠組織的激素及細胞因子檢測結(jié)果顯示，DHT組的組織睪酮濃度與K組、F組比較有顯著性差異(P<0.05)，丹參酮對AGA模型大鼠組織的睪酮濃度無明顯影響；D組、F組的組織αFGF的濃度與DHT組相比明顯升高(P<0.05)，表明丹參酮能夠顯著提升AGA模型大鼠的組織αFGF濃度，且丹參酮提升大鼠組織αFGF的水平高于非那雄胺(表2)。

圖2 2a：二氫睪酮造模組毛囊數(shù)量少，部分毛囊處于休止期或退行期，見毛囊微小化，皮下脂肪層明顯變薄(HE,×200)；2b：丹參酮組毛囊數(shù)量較多，多處于生長期，毛囊微小化不明顯(HE,×200)；2c：非那雄胺組病理可見較完整的處于生長期的毛囊(HE,×200)

2.3 組織病理學 典型的AGA組織病理學表現(xiàn)以終毛毳毛化為特征，DHT組的組織病理顯示，毛囊的數(shù)量減少，部分毛囊處于休止期或退行期，可見毛囊微小化，皮下脂肪層明顯變??；而D組的毛囊數(shù)量較多，毛囊多處于生長期，未見到明顯的毛囊微小化；F組的組織病理可見較完整的毛囊，毛囊處于生長期(圖2)。

3 討論

雄激素性禿發(fā)是臨床上最常見的非瘢痕性脫發(fā)，流行病學調(diào)查顯示我國目前有約1.3億AGA患者。AGA作為損容性疾病[12]，患者頭頂部及額顳部的毛發(fā)稀疏甚則缺失對其外在形象及自信心產(chǎn)生了極大的負面影響，早期應(yīng)用安全、有效的治療對改善AGA患者發(fā)量、樹立患者健康、自信形象至關(guān)重要。研究顯示丹參酮治療AGA能夠有效改善頭皮油脂分泌、增加毛發(fā)數(shù)量[13]，但其作用機制尚不明晰。

本研究應(yīng)用丹參酮對DHT誘導(dǎo)的AGA模型大鼠進行治療，通過觀察大鼠背部毛發(fā)改變、檢測大鼠血清及局部組織的激素和細胞因子水平、分析大鼠背部皮膚毛囊的組織病理學特征，探討丹參酮治療AGA的作用機制。

雄激素性禿發(fā)與性激素代謝、毛囊微環(huán)境炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5]，本實驗應(yīng)用ELISA法檢測AGA模型大鼠血清及毛發(fā)組織相關(guān)激素、細胞因子水平以分析丹參酮在分子水平的相關(guān)作用。其中TNF-α、TGF-β1對毛發(fā)生長具有抑制作用。TNF-α作用于毛囊導(dǎo)致營養(yǎng)不良性生長期毛囊形成，組織病理學顯示毛囊形態(tài)改變，毛囊球部和內(nèi)根鞘角化異常，毛囊黑素細胞被破壞[14]。TGF-β1是雄激素誘導(dǎo)毛乳頭細胞分泌的[15,16]直接抑制頭皮前部上皮細胞生長的細胞因子[17]，導(dǎo)致毛囊微型化，抗TGF-β1的抗體能夠拮抗其產(chǎn)生的上皮細胞的生長抑制作用[17,18]；研究顯示[19]TGF-β1的表達增加可能導(dǎo)致毛囊周圍纖維化，使毛囊加速進入生長中期，進一步導(dǎo)致毛囊萎縮；有研究在小鼠的生長期毛囊中注射TGF-β1，可致小鼠毛囊提前進入休止期[20]，表明TGF-β1是誘導(dǎo)毛發(fā)進入退行期的重要因子。αFGF對毛發(fā)生長具有促進作用，能夠促進新生血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細胞，體外實驗顯示αFGF能夠促進真皮乳頭細胞和表皮角質(zhì)形成細胞的DNA合成，對于刺激毛發(fā)生長具有正向調(diào)節(jié)作用[21]。

雄激素是AGA發(fā)病的直接誘發(fā)因素[22]，其中最主要的是DHT，DHT含量在AGA患者的禿發(fā)區(qū)頭皮明顯增加[23]，是導(dǎo)致AGA的關(guān)鍵因素[24]，且DHT與雄激素受體(AR)有很強的結(jié)合力，其親和力是睪酮的5倍以上[25]，生物效能是睪酮的10倍，DHT與AR結(jié)合形成AR-DHT復(fù)合物，進入細胞核，參與調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學效應(yīng)[26]，促使毛乳頭細胞產(chǎn)生更多TGF-β1[27]，TGF-β1阻止毛囊內(nèi)細胞的增殖、激活細胞內(nèi)在的凋亡通路，引起毛囊內(nèi)細胞主動死亡、引起毛囊微小化，進一步導(dǎo)致脫發(fā)。Sawaya等[28]認為DHT可能是通過選擇性的調(diào)節(jié)凋亡蛋白酶的基因表達(如CASPASE-3、CASPASE-9等)來影響毛發(fā)生長的。雄激素同時招募相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白影響毛發(fā)生長，其中研究比較多的是Dickkopfs家族相關(guān)蛋白DKK-1，DKK-1是誘導(dǎo)毛囊再生和毛干生長的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子，在DHT的作用下DKK-1表達增加，抑制毛囊外根鞘細胞的生長、促使細胞凋亡[29]。

在本實驗中，DHT組大鼠背部毛發(fā)與K組大鼠相比明顯稀疏，部分毛發(fā)脫落，毛發(fā)分布凌亂，呈灰黃色，缺乏光澤，毛干纖細、干枯，表面有較多油脂顆粒附著；DHT組大鼠血清TNF-α、TGF-β1濃度均較K組明顯升高(P<0.05)，提示AGA模型大鼠造模成功。

D組大鼠背部毛發(fā)與DHT組大鼠比較毛發(fā)分布整齊，毛發(fā)較為濃密，毛色光澤度較好，毛發(fā)表面無明顯油脂顆粒附著；D組大鼠血清雌二醇濃度較DHT組顯著升高(P<0.05)，血清二氫睪酮濃度較DHT組明顯降低(P<0.05)，其組織內(nèi)αFGF的濃度顯著高于DHT組(P<0.05)。

以上實驗結(jié)果表明丹參酮膠囊能夠顯著降低循環(huán)中的DHT水平，調(diào)節(jié)性激素代謝，這與丹參酮的臨床研究結(jié)果一致，認為丹參酮可以降低患者外周血的雄激素水平[30,31]。丹參酮降低血雄激素水平表現(xiàn)在其具有雌激素樣活性和明顯抗雄激素樣活性作用[32]，丹參酮的主要成分隱丹參酮能夠降低模型雄鼠17-羥孕酮(17-OHP)水平，17-OHP是睪酮的前體物質(zhì)，從而有效拮抗雄激素的合成[33]，同時有研究[34]顯示丹參酮分子的鄰醌結(jié)構(gòu)可與機體中的單胺類指標發(fā)生親核反應(yīng)，而下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)指標多為單胺類物質(zhì)，因此調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸可能是丹參酮改善激素水平代謝的機制之一。

AGA病理表現(xiàn)為毛囊體積及密度逐漸縮小，終毛向毳毛轉(zhuǎn)化，生長期與休止期毛囊比例不斷下降[18]，DHT組的組織病理顯示，毛囊的數(shù)量減少，部分毛囊處于休止期或退行期，可見毛囊微小化，皮下脂肪層明顯變?。欢鳧組的毛囊數(shù)量較多，且毛囊多處于生長期，未見到明顯的毛囊微小化。提示丹參酮治療AGA可能與其調(diào)節(jié)毛囊周期，維持毛囊數(shù)量有關(guān)。

實驗結(jié)果顯示F組治療AGA模型大鼠能夠提升血清雌二醇水平、降低DHT水平，這與非那雄胺的作用機制及導(dǎo)致的激素調(diào)節(jié)負反饋相關(guān)，F(xiàn)組提升雌二醇的水平略高于D組，但并無統(tǒng)計學差異。非那雄胺顯著地提高了毛發(fā)組織的αFGF水平，但D組的提升程度稍高于F組。本實驗中非那雄胺與丹參酮對AGA模型大鼠的治療作用未顯示出明顯的差異，可能與實驗時間較短、檢測指標等因素相關(guān)，需進一步設(shè)計實驗以研究兩種治療藥物的干預(yù)特點。