消銀湯對銀屑病樣模型小鼠TNF-α及IL-10的影響*

宋紅霞，薛曉東

1重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校藥理教研室，重慶 萬州 404000；2重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校附屬醫(yī)院皮膚科

銀屑病是一種常見易復發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，目前該病病因不明，近年來多認為是一種T細胞介導的自身免疫性疾病［1］。消銀湯源自筆者導師多年臨床經驗方，后根據自身臨床體會加減而成。為進一步證實其療效及作用機制，現(xiàn)采用消銀湯干預銀屑病小鼠動物模型，并檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素10(IL-10)的水平，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種雌性小鼠60只，SPF級，體質量18～22 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SYXK(渝)2012-0001；小鼠在溫度16～26℃，相對濕度40%～70%的實驗環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 藥物 消銀湯藥物組成：黃芩10 g，生地黃15 g，牡丹皮 12 g，赤芍 15 g，半枝蓮 30 g，白花蛇舌草 15g，槐花 10g，紫草 10g，玄參 15g，丹參 15g，雞血藤15 g，甘草6 g。制備方法：稱取各藥材，用水煎煮2次，煎出液合并，濃縮到每劑藥168 mL。消銀湯的人體推薦攝入量為每天168 g生藥，相當于2.8 g/(kg·d)生藥(成人以60 kg計)。

1.3 主要試劑及設備 甲氨蝶呤片(上海信誼藥業(yè)有限公司，批號：20130403)；秋水仙堿注射液(吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，批號：20130915)；己烯雌酚注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：130203)；小鼠 TNF-α及 IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：201310)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LP-400型酶標儀(法國巴斯德公司)。

1.4 消銀湯對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響［2-4］取昆明種雌性小鼠60只，隨機選取10只作為空白對照組，其余每只小鼠腹腔注射0.2 mg己烯雌酚，1次/d，連續(xù)注射3天，使小鼠處于雌激素期。3天后隔天腹腔注射己烯雌酚(0.2mg/只)，至實驗結束。第4天將模型小鼠隨機分為5組，每組10只，即模型組及甲氨蝶呤組(2 mg/kg，相當于臨床等效劑量，用生理鹽水配制成所需濃度)，消銀湯高(69.0 g/kg)、中(34.5 g/kg，相當于臨床等效劑量)、低(17.3 g/kg)劑量組，各組灌胃給藥，每天2次，連續(xù)14天，給藥容積為35 mL/kg?？瞻讓φ战M和模型組給予等容積的生理鹽水。末次給藥2小時后，每只小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，使細胞有絲分裂周期停滯于有絲分裂中期，便于計數(shù)。6小時后摘小鼠眼球取血，室溫靜置15分鐘，3 000 r/min離心15分鐘后分離血清，置于-70℃保存，用于TNF-α，IL-10的濃度測定。處死小鼠后，切取陰道組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光鏡下觀察有絲分裂情況，計數(shù)300個基底細胞中的有絲分裂數(shù)，折算出有絲分裂指數(shù)(即每100個基底細胞中的有絲分裂數(shù))。比較各組小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂指數(shù)，并作統(tǒng)計學處理。

1.5 ELISA法檢測血清TN F-α，IL-10 從-70℃冰箱取出各組血清樣本，恢復至室溫，按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據處理和統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 消銀湯對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響 消銀湯高、中、低劑量對小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂有明顯的抑制作用，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且呈良好的量效關系。甲氨蝶呤也能明顯抑制小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂(P＜0.01)。消銀湯中、低劑量對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的抑制作用與甲氨喋呤相近(P＞0.05)，消銀湯高劑量對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的抑制作用較甲氨喋呤強(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠陰道上皮細胞有絲分裂情況(±s)

表1 各組小鼠陰道上皮細胞有絲分裂情況(±s)

注：*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與甲氨蝶呤組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) 有絲分裂指數(shù)空白對照組 10 - 10.47±2.31*模型組 10 - 19.81±3.15消銀湯高劑量組 10 69.0 12.79±1.34*#消銀湯中劑量組 10 34.5 15.33±2.19*消銀湯低劑量組 10 17.3 16.00±2.92*甲氨蝶呤組 10 0.002 15.06±2.00*

2.2 消銀湯對小鼠血清TN F-α或IL-10含量的影響 與空白對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α的含量明顯升高(P＜0.01)，IL-10的含量明顯降低(P＜0.01)；與模型組相比，消銀湯高、中劑量組小鼠血清中 TNF-α的含量明顯降低(P＜0.01)，IL-10的含量均有升高(P＜0.05)，見表2。

表2 消銀湯對小鼠血清TN F-α、IL-10含量的影響(±s)

表2 消銀湯對小鼠血清TN F-α、IL-10含量的影響(±s)

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，○表示P＜0.05，△表示 P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) TN F-α/(ng·m L-1) IL-10(ng·m L-1)空白對照組 10 - 1.64±0.84# 7.30±1.58#模型組 10 - 3.80±0.77 3.35±1.79消銀湯高劑量組 10 69.0 1.96±0.66#△ 6.72±2.18#消銀湯中劑量組 10 34.5 2.27±0.49#○ 5.63±2.08*消銀湯低劑量組 10 17.3 3.09±0.76 3.51±1.48○甲氨蝶呤組 10 0.002 3.20±1.18 5.31±1.98

3 討論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是一種以紅斑鱗屑為主的慢性炎癥性皮膚病，特征性損害為紅色丘疹或斑塊上覆有多層銀白色鱗屑［5-7］。本病病程較長，病因和發(fā)病機制復雜。目前銀屑病發(fā)病機制主要有遺傳因素、感染因素、免疫因素、神經精神因素、內分泌因素等［8］。近年有研究［9］表明銀屑病存在著免疫異常，而細胞因子作為免疫調節(jié)的物質基礎在銀屑病的發(fā)病中起重要作用。TNF-α是一種與銀屑病免疫炎癥反應密切相關的細胞因子，它不僅能夠誘導皮膚內黏附因子表達而促進淋巴細胞的浸潤，而且能夠促進朗格漢斯細胞的成熟，增強其活化T細胞的能力［10］。IL-10是一種較強的抗炎因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-10可使銀屑病表皮厚度變薄，抑制角質形成細胞過度增殖和分化［11］。IL-10在IL-4輔助下可激活Th 2型細胞并抑制Th1型細胞功能，在IL-10相對或絕對缺乏的情況下會導致銀屑病的發(fā)生［12］。

雌激素期的小鼠陰道上皮細胞增殖活躍，有絲分裂增加，并且上皮細胞轉換加快，可以模擬銀屑病表皮增殖過快的特點，通過比較小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂指數(shù)較好地評價藥物抑制細胞有絲分裂的作用［13］。該模型被作為篩選抗銀屑病藥物的常用模型［14］。

本實驗通過建立小鼠陰道上皮模型，隨后給予不同劑量的消銀湯進行干預，考察消銀湯對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂及血清細胞因子TNF-α、IL-10的影響。結果顯示消銀湯各劑量組均可明顯抑制銀屑病樣小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂，高、中劑量可明顯降低TNF-α的含量，升高IL-10的水平，提示消銀湯對銀屑病小鼠具有的治療作用可能與其抑制表皮細胞增殖并降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平有關。

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