四磨湯通過調(diào)控NF-κB信號通路改善重度膿毒癥大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞屏障功能障礙炎癥狀態(tài)作用研究

溫劍藝,王首紅,劉艷紅,張崇健,郭偉新

(廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣東 廣州 510080)

膿毒癥是重癥患者死亡的重要原因之一[1]。研究顯示[2]腸道組織是膿毒癥早期受累以及重度膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的靶器官之一,而腸道上皮細(xì)胞屏障功能障礙是多器官以及組織衰竭的“始動”因子。Guo等[3]研究顯示在膿毒癥小鼠模型中,核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號被激活,磷酸化NF-κB65 (NF-κB p65)的表達(dá)明顯升高,動物血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等水平明顯升高,炎癥性應(yīng)激加劇,患者腸道組織的免疫屏障標(biāo)志物白細(xì)胞共同抗原(CD45)以及腸道上皮細(xì)胞機(jī)械屏障的標(biāo)志物閉合蛋白1(Claudin-1)和閉鎖蛋白1(ZO-1)的表達(dá)明顯下降,動物結(jié)腸組織的病理損傷明顯加重。Xie等[4]研究指出,在膿毒癥患者中,炎癥性應(yīng)激的晚期介質(zhì)高遷移率蛋白-1(HMGB1)以及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)伴隨NF-κB p65的表達(dá)驟增是膿毒癥趨于惡性進(jìn)展的標(biāo)志性事件。四磨湯出自《濟(jì)生方》,主要由木香、枳殼、烏藥、檳榔四味中藥組成,在臨床上被稱作“胃腸動力劑”[5]。本研究以盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)模擬膿毒癥狀態(tài),構(gòu)建大鼠重度膿毒癥模型,從NF-κB信號入手,以NF-κB信號通路激活劑佛波酯(PMA)進(jìn)行功能挽救實(shí)驗(yàn),探討四磨湯對重度膿毒癥大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:SD大鼠,雄性,SPF級,50只,7～8周齡,體重220～250 g,購自廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司,生產(chǎn)批號:SCXK(粵)2022-0064。在我院SPF級基礎(chǔ)動物房中,設(shè)定溫度(25±2)℃,濕度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗周期的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:NF-κB信號通路激活劑(PMA,美國Selleck公司),四磨湯口服液 (主要成分有木香、枳殼、烏藥、檳榔,湖南漢森制藥股份有限公司,規(guī)格:10 ml,國藥準(zhǔn)字 Z20025044),多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇等(武漢華美生物技術(shù)有限公司),兔抗大鼠NF-κB、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗大鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢凱基生物技術(shù)公司),末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記(TUNEL)(北京中杉生物公司),免疫組化、免疫熒光、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)試劑盒(美國Bio-Rad公司),酶聯(lián)吸附試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:超低溫冰箱(日本三洋公司),DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid顯微鏡(美國Discover ECHO公司),Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer 酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司),Tundra 冷凍透射電子顯微鏡(Cryo-TEM) (荷蘭賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠重度膿毒癥模型建立:根據(jù)Bi等[6]介紹的方法通過CLP術(shù)構(gòu)建動物模型,腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉將動物麻醉,無菌操作臺上,以仰臥位進(jìn)行固定后,腹部備皮,沿腹正中線剪開約1 cm切口,移出腹腔中的盲腸,結(jié)扎其根部,在顯微鏡下,刺穿盲腸,擠壓盲腸,排出腸內(nèi)容物后,逐層關(guān)腹。

造模術(shù)后4 h,對實(shí)驗(yàn)動物從毛發(fā)豎立、腹瀉、結(jié)膜炎以及昏睡程度進(jìn)行行為學(xué)評分,每項(xiàng)評分如下:無,記為0分;輕度,記為1分;中度,記為2分;重度,記為3分,總分為12分,評分在6～12分視為造模成功[7]。

1.2.2 大鼠分組處理[8]:按照隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動物分為正常組、模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組。其中模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠按照上述造模術(shù)進(jìn)行造模,而正常組大鼠在造模過程中僅暴露盲腸即可。

造模成功后30 min,四磨湯低劑量組大鼠每日定時(shí)以7.56 ml/kg的四磨湯進(jìn)行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射;四磨湯高劑量組大鼠每日定時(shí)以15.12 ml/kg的四磨湯進(jìn)行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射;激活劑組每日定時(shí)大鼠以15.12 ml/kg的四磨湯進(jìn)行灌胃處理的同時(shí)并以5 mg/kg的PMA進(jìn)行腹腔注射;而正常組和模型組大鼠每日定時(shí)以等劑量的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃處理和腹腔注射,各組大鼠單籠飼養(yǎng),自由飲水與攝食,連續(xù)給藥14 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)

1.3.1 各組大鼠的一般狀況以及血清指標(biāo)檢測:在實(shí)驗(yàn)過程中,每日記錄大鼠的進(jìn)食與飲水情況、精神狀態(tài)、活動量、皮毛狀態(tài)等日常行為參數(shù)。在末次給藥結(jié)束后,將大鼠禁食不禁水12 h,尾靜脈留取5 ml血液標(biāo)本,離心后留取上清,按酶聯(lián)吸附試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液,終止反應(yīng),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,酶標(biāo)儀檢測血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 各組大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)檢測:留取血液完畢,處死大鼠,顯微鏡下,逐層開腹,至暴露大鼠的結(jié)腸組織,在手術(shù)剪的幫助下,將大鼠的結(jié)腸組織取出,觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜的狀態(tài)。將大腸結(jié)腸縱向剖開,觀察其宏觀損傷情況并進(jìn)行評分:無充血、粘連,并且無水腫潰瘍點(diǎn)記為0分;局部出現(xiàn)水腫、粘連或充血記為1分,并且每增加1個(gè)充血灶點(diǎn)評分即增加1分[9]。之后,以4%多聚甲醛將結(jié)腸組織固定,包埋,切片,脫蠟,進(jìn)行HE、PAS染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織的病理損傷,統(tǒng)計(jì)每100個(gè)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.3 各組大鼠結(jié)腸組織的細(xì)胞凋亡:取大鼠的結(jié)腸組織,常規(guī)固定,制成切片,按TUNEL試劑盒要求檢測各組大鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞的凋亡情況,在顯微鏡下,凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,正常細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。Image J圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。

1.3.4 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP 的表達(dá):取大鼠的結(jié)腸組織,多聚甲醛固定,BSA封閉,加入一抗(HMGB1和NLRP3的稀釋比例均為1∶100),在4 ℃下避光孵育過夜,充分清洗后,加入抗熒光二抗,防淬滅劑封片,鏡下觀察。

1.3.5 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá):取大鼠的結(jié)腸組織,經(jīng)固定,切片,脫蠟,脫水,抗原修復(fù),封閉后,依次加入一抗(兔抗CD45、ZO-1和Claudin-1的稀釋比例均為1∶200)、二抗(1∶1000),洗滌3次,常溫下復(fù)染、封片后,鏡下觀察,當(dāng)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為目標(biāo)蛋白表達(dá)[11],結(jié)果判定:①按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分,0分,陽性細(xì)胞數(shù)≤5%;1分,6%<陽性細(xì)胞數(shù)≤25%;2分,26%<陽性細(xì)胞數(shù)≤75%;3分,>76%。②按細(xì)胞著色強(qiáng)度評分,0分,無著色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色;將兩項(xiàng)評分的乘積作為總評分。

1.3.6 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax的表達(dá):取各組大鼠的結(jié)腸組織,通過RIPA裂解液提取樣本中的總蛋白,待測定其濃度后,進(jìn)行加熱變性,取50 μg上樣,電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉,加入兔抗大鼠NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax一抗(各蛋白的稀釋比例均為1∶500),過夜,洗滌3次,二抗(1∶1500)稀釋后,室溫孵育,洗滌,顯影后,以GAPDH為參照[12],Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn);P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)和行為學(xué)評分比較 見表1。在實(shí)驗(yàn)過程中,正常組大鼠精神狀態(tài)、運(yùn)動量、皮毛、進(jìn)食與飲水量、排泄以及肛周未見異常;模型組大鼠精神狀態(tài)萎靡,懶動,結(jié)膜炎嚴(yán)重,反應(yīng)遲鈍,皮毛豎立且暗淡無光,進(jìn)食與飲水減少,肉眼可見稀水樣便,肛周明顯不清潔;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組的行為明顯改善,尤以四磨湯高劑量組大鼠改善的程度最為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)統(tǒng)計(jì)分析顯示,四磨湯能明顯改善重度膿毒癥大鼠的行為,而PMA能部分逆轉(zhuǎn)這一作用,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分比較(分)

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織的解剖學(xué)、病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)損傷以及結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞的變化 肉眼觀察結(jié)腸黏膜,正常組大鼠結(jié)腸黏膜光滑未見異常;模型組大鼠的結(jié)腸黏膜顏色偏暗,結(jié)腸黏膜變薄,明顯腫脹,可見明顯的充血灶點(diǎn)或出血條帶;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠的結(jié)腸黏膜腫脹明顯減輕,充血灶點(diǎn)明顯減少或出血區(qū)域明顯減小,尤以四磨湯高劑量組最為明顯。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織宏觀評分比較(分)

HE染色顯示,正常組大鼠結(jié)腸黏膜各層分層清晰,未見異常,腸微絨毛正常,大腸腺結(jié)構(gòu)清晰,分布豐富;模型組大鼠黏膜各層出現(xiàn)不同程度的水腫,炎性細(xì)胞大量浸潤,腸微絨毛或脫落或丟失,大腸腺明顯萎縮;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯改善,炎性浸潤明顯緩解,尤以四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織黏膜損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織損傷病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色,×400)

腸道黏膜屏障的黏蛋白經(jīng)PAS染色后,呈酒杯狀的顆粒狀[13];本研究PAS結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結(jié)腸組織中的杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡率比較 見表4。TUNEL染色結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞凋亡率明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞凋亡率明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞凋亡率明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中的細(xì)胞凋亡率明顯上升,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較 見表5。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測結(jié)果顯示,在模型組中,大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明顯升高,四磨湯能明顯抑制大鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,PMA能部分逆轉(zhuǎn)這一作用,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較(ng/L)

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較 見表6。免疫熒光檢測HMGB1和NLRP3的表達(dá)結(jié)果顯示,模型組結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達(dá)明顯升高;四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達(dá)明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達(dá)比較 見表7(圖2)。免疫組化結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達(dá)比較(免疫組化染色,×400)

表7 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1免疫組化評分比較(分)

2.7 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較 見表8。Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達(dá)明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達(dá)明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達(dá)明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達(dá)明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達(dá)明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達(dá)明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達(dá)明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表8 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較

3 討 論

膿毒癥是累及肺、肝、腎、心、腦、腸等器官和組織的炎癥反應(yīng)綜合征,腸道上皮損傷是重度膿毒癥的重要因素之一[14]。因此深入闡明腸道上皮屏障損傷的分子機(jī)制,在該領(lǐng)域中具有重大意義。

膿毒癥在中醫(yī)學(xué)中隸屬于“疽毒內(nèi)陷”“外感熱病”等范疇,機(jī)體因“正虛毒損,脈絡(luò)失司”以至于熱、虛、毒、瘀橫行脈絡(luò),主要在“益氣溫陽、清熱解毒、扶正祛邪、活血化瘀”的指導(dǎo)下形成了參附注射液、清熱解毒方、香砂六君子湯、四磨湯、參白解毒方等名方用于臨床上膿毒癥的治療,顯示了較為穩(wěn)定的療效[15]。四磨湯為理氣扶陽的代表藥方,由木香、枳殼、烏藥、檳榔組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[16],四磨湯以及其活性組分具有良好的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、臟器保護(hù)以及調(diào)節(jié)胃腸動力的作用。Yi等[17]研究顯示在脾虛型便秘小鼠模型中,四磨湯能調(diào)控實(shí)驗(yàn)動物結(jié)腸黏膜組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá),緩解動物結(jié)腸黏膜組織的病理損傷。周慧等[18]研究顯示在心力衰竭大鼠模型中,四磨湯的應(yīng)用能明顯抑制動物體內(nèi)炎癥性應(yīng)激的級聯(lián)放大,下調(diào)動物血清中TNF-α和IL-6的水平。本研究中以CLP構(gòu)建大鼠膿毒癥模型后,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中的細(xì)胞凋亡率明顯下降,結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)升高,而HMGB1和NLRP3的表達(dá)降低,結(jié)腸組織病理損傷,結(jié)腸黏膜的黏膜蛋白損傷均明顯減輕,證實(shí)四磨湯對疾病的干預(yù)作用。

腸道黏膜組織是機(jī)體抵御有害物質(zhì)和病原微生物入侵的第一道防線。NF-κB信號是炎癥性應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一,在膿毒癥發(fā)生后,NF-κB被激活,NF-κB p65的表達(dá)升高,攜帶炎性信號入核,一方面能促進(jìn)TNF-α和IL-6的分泌以及釋放,炎癥性應(yīng)激呈現(xiàn)級聯(lián)放大的“瀑布樣”[19],另一方面促進(jìn)晚期炎癥介質(zhì)HMGB1和NLRP3的表達(dá),推動炎癥性應(yīng)激的進(jìn)一步放大[20];同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞中Bax表達(dá)的升高,下調(diào)Bcl-2的表達(dá),誘使細(xì)胞凋亡,結(jié)腸黏膜損傷加劇[21]。本研究中以NF-κB信號激活劑PMA進(jìn)行功能挽救,結(jié)果顯示PMA能部分逆轉(zhuǎn)四磨湯對結(jié)腸黏膜的修復(fù)作用,證實(shí)四磨湯通過抑制NF-κB信號而發(fā)揮作用。

綜上所述,四磨湯能明顯抑制重度膿毒癥大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的炎癥應(yīng)激狀態(tài),緩解結(jié)腸組織的病理損傷,改善結(jié)腸黏膜的屏障功能,這可能與抑制NF-κB信號的磷酸化有關(guān)。但是四磨湯是否還通過調(diào)控其他信號影響疾病的進(jìn)展,仍需更為深入地研究。