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    CCDC34 在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系

    2020-05-11 08:46:44支小飛陳思俊華如衡朱建偉
    中國普通外科雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株微血管胃腸道

    支小飛,陳思俊,華如衡,朱建偉

    (南通大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科,江蘇 南通 226001)

    胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是起源于胃腸道肌層的間葉源性腫瘤,發(fā)病率約1~2/10 0000,約占胃腸道惡性腫瘤1%~3%[1]。手術(shù)治療是目前主要的治療手段,但術(shù)后仍有40%~80%的GIST患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]。因此,研究GIST發(fā)生機(jī)制并尋找有效治療手段迫在眉睫。GIST發(fā)生發(fā)展過程極其復(fù)雜,涉及多種分子信號通路參與。

    卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白34(coiled-coil domaincontaining 34,CCDC34)在1例視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮聯(lián)合錯構(gòu)瘤患者中首次發(fā)現(xiàn),也被稱為NY-REN-41,包括373個氨基酸,位于11p14.1染色體上。目前研究發(fā)現(xiàn),CCDC34在膀胱癌[3]、宮頸癌[4]、直腸癌[5]和肝癌[6]等多種腫瘤中過表達(dá),促進(jìn)其細(xì)胞增殖和遷移。Hu等[7]在食管鱗狀細(xì)胞癌中CCDC34差異表達(dá)水平與ESCC組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān),且高表達(dá)CCDC34患者預(yù)后不良。除此之外,他們還發(fā)現(xiàn)CCDC34和VEGF之間存在明顯的相關(guān)性。Qi等[8]研究表明在胰腺癌細(xì)胞中沉默CCDC34后通過抑制PI3K/Akt信號通路阻滯腫瘤血管生成等作用。由此可以看出CCDC34在腫瘤血管生成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而,CCDC34在GIST中的表達(dá)水平和作用尚不清楚,本研究通過分析GIST組織中CCDC34的表達(dá)和微血管密度(microvessel density,MVD)的數(shù)量,并在荷瘤鼠模型上探討其對GIST血管生成的作用及機(jī)制,為臨床治療GIST,提供理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來源

    收集2018年1月—2019年2月我院病理科經(jīng)外科切除的GIST組織標(biāo)本84例,患者年齡45~79歲,平均(5 5.2 5±7.2 1)歲;腫瘤位于胃4 8 例,小腸2 0 例,結(jié)直腸8 例及胃腸外8 例;組織學(xué)分型:上皮樣細(xì)胞型5例,梭形細(xì)胞型71例和混合細(xì)胞型8例;32例局部侵犯(浸潤消化道壁或鄰近臟器);3 1 例有壞死,3 4 例轉(zhuǎn)移(盆腹腔轉(zhuǎn)移1 5 例,肝轉(zhuǎn)移5 例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4 例);腫瘤最大徑0.4~25 cm。另選取30例正常胃腸道黏膜組織作為對照,所有患者年齡4 6 ~7 8 歲,平均(54.16±5.12)歲。

    1.2 實驗材料

    C C D C 3 4 p c D N A 過表達(dá)載體(采用的質(zhì)粒為pLVX-IRES-Hyg)、CCDC34干擾載體(采用pRNAT-u6.2載體),其對應(yīng)的包裝質(zhì)粒均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計和構(gòu)建;兔抗CCDC34單克隆抗體、兔抗人C D 3 4 單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt單克隆抗體、兔抗人VEGF-C單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔二抗購自英國Abcam公司;蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、DAB免疫組織化學(xué)顯色試劑盒、發(fā)光試劑盒、潮霉素B、遺傳霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司;293T和GIST882細(xì)胞株購自上海研生實業(yè)有限公司。4周齡雄性BALB/c裸鼠,體質(zhì)量為12~15 g,購買于南京大學(xué)模式動物研究所。TransLvTMLentivirus qPCR Titration Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司

    1.3 免疫組化檢測染色及結(jié)果判讀

    1.3.1 免疫組化檢測 經(jīng)常規(guī)石蠟包埋標(biāo)本,制備5 μm 厚連續(xù)切片。3%H2O210 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,正常家兔血清室溫封閉10 min,加入一抗于4 ℃孵育過夜。次日,PBS 沖洗3 次,生物素化羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min,PBS 沖洗3 次,辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素37 ℃孵育45 min,漂洗后DAB 顯色,蘇木素復(fù)染封片,中性樹脂封片,鏡下觀察并獲得圖像。

    1.3.2 結(jié)果判定 以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性,染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為基本不著色記0 分,淺黃色記1 分,棕黃色記2 分,棕褐色記3 分;陽性細(xì)胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)為:0%記0 分,1%~25%記1 分,26%~50% 記2 分,51%~75% 記3 分,76%~100% 記4 分。兩項指標(biāo)評分乘積,判定結(jié)果如下:陰性為0~3 分、4~12 分為陽性。以不含一抗的標(biāo)本作為陰性對照。

    1.3.3 MVD 計數(shù) 腫瘤邊緣區(qū)微脈管計數(shù)采用郭黎姣等[8]的方法。用CD34 標(biāo)記微血管,先于40 倍光鏡下選出3 個微血管著色最密集的區(qū)域,然后在200 倍視野下計數(shù)微血管。判定結(jié)果如下:被抗體染色的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)記為1 個微血管,排除管徑>8 個紅細(xì)胞直徑及匯管區(qū)血管。MVD 數(shù)量為3 個視野的均值。

    1.4 CCDC34 干擾/ 過表達(dá)GIST882 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立

    1.4.1 CCDC34 過表達(dá)GIST882 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 具體步驟參照文獻(xiàn)[9],將包裝質(zhì)粒1、2 和CCDC34 pcDNA 過表達(dá)載體按照5:3:2 比例加入到opti-MEM 中混勻,另用轉(zhuǎn)染試劑PEI 將opti-MEM 預(yù)混。室溫靜置20 min 后,將兩者混合。緩慢加入293T 細(xì)胞中。分別于24、48 h 收集2 次病毒備用,采用TransLvTMLentivirus qPCR Titration Kit 檢測慢病毒的滴度。將獲得的病毒感染SKOV3 細(xì)胞(MOI=20),采用潮霉素B 進(jìn)行篩選出CCDC34 過表達(dá)GIST882 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

    1.4.2 CCDC34 干擾GIST882 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 基本操作如1.4.1。最后采用遺傳霉素進(jìn)行篩選出CCDC34 干擾GIST882 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

    1.5 動物造模及分組

    將無處理的G I S T 8 8 2 及C C D C 3 4 干擾/過表達(dá)GIST882細(xì)胞株于培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代后,調(diào)整密度為1×107個/mL,在裸鼠第二乳墊部皮下注射0.2 m L 細(xì)胞液,建立6 0 只荷瘤鼠,分為模型組(無處理的GIST882細(xì)胞)、CCDC34干擾組(CCDC34干擾GIST882細(xì)胞)和CCDC34過表達(dá)組(CCDC34過表達(dá)GIST882細(xì)胞),每組各 20只。在接種部位乳墊處出現(xiàn)質(zhì)地較硬,腫瘤結(jié)節(jié)認(rèn)為造模成功。3周后處死裸鼠,完整切除腫瘤組織。

    1.6 Western blot 實驗

    收集各組細(xì)胞/組織裂解,用BCA定量裂解的蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉封閉。用一抗在室溫下孵育2 h、洗膜;用羊抗兔HRP二抗在室溫下孵育1 h、洗膜,ECL顯影?;瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

    所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,符合正態(tài)分布的計量資料,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料用例數(shù)(百分比)[n(%)]表示,組間率的比較采用χ2檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 GIST 組織和正常胃腸道黏膜組織CCDC34表達(dá)

    免疫組化染色顯示,CCDC34在GIST組織中的陽性表達(dá)率(86.90%,73/84)明顯高于正常胃腸道黏膜組織的(16.67%,5/30)(χ2=98.175,P=0.001)(圖1)。

    2.2 CCDC34 表達(dá)與GIST 患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性

    CCDC34表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型等無關(guān)(均P>0.05),而與腫瘤的危險度分級、腫瘤大小、腫瘤細(xì)胞核分裂象和局部侵犯、壞死和轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)(表1)。

    2.3 GIST 組織中的CCDC34 與MVD 計數(shù)的相關(guān)性

    S p e a r m a n 相關(guān)分析表明,C C D C 3 4 表達(dá)與M V D 計數(shù)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性(r=0.6 9 5,P<0.001)(圖2)。

    2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果

    與空白對照組比較,CCDC34干擾組GIST882細(xì)胞CCDC34蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。CCDC34過表達(dá)組GIST882細(xì)胞CCDC34蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。CCDC34的蛋白表達(dá)在空白對照組、干擾對照組和過表達(dá)對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)(圖3)。

    表1 CCDC34 表達(dá)與GIST 患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]Table 1 Relations of CCDC34 expression with the clinicopathologic characteristics of the GIST patients [n (%)]

    圖2 CCDC34 表達(dá)與MVD 計數(shù)的關(guān)系 A:在GIST 組織CCDC34 表達(dá)量與MVD 計數(shù)值散點(diǎn)圖;B:GIST 組織中的CCDC34 與MVD 計數(shù)之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖Figure 2 Relationship between CCDC34 expression and MVD count A: Scatter plot of CCDC34 expression levels and MVD counts in GIST tissues; B: Scatter plot of correlation between CCDC34 expression and MVD count in GIST tissues

    圖3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency detected by Western blot analysis

    2.5 各組移植瘤MVD 計數(shù)值比較

    以C D 3 4 標(biāo)記的微血管進(jìn)行M V D 計數(shù)值分析,結(jié)果顯示,與模型組移植瘤M V D 計數(shù)(1 8.5 2±3.2 6)比較,C C D C 3 4 過表達(dá)組裸鼠移植瘤M V D 計數(shù)(2 9.5 6±2.4 9)明顯增加(t=11.63,P<0.01);CCDC34干擾組裸鼠移植瘤MVD計數(shù)(6.21±1.52)明顯降低(t=14.64,P<0.01)(圖4)。

    圖4 各組移植瘤MVD 計數(shù)檢測(×200) A:模型組;B:CCDC34 過表達(dá)組;C:CCDC34 干擾組Figure 4 Detection of MVD counts in the tumor xenografts of each group A: Model group; B: CCDC34 overexpression group; C: CCDC34 interference group

    2.6 各組移植瘤組織中PI3K、p-Akt、VEGF-C表達(dá)

    與模型組比較,C C D C 3 4 過表達(dá)組移植瘤組織中P I 3 K、p-A k t、V E G F-C 明顯增加(均P<0.05);CCDC34干擾組移植瘤組織中PI3K、p-Akt、VEGF-C明顯降低(均P<0.05)(圖5)。

    圖5 各組移植瘤組織中PI3K、p-Akt、VEGF-C 表達(dá)比較Figure 5 Comparison of expressions of PI3K, p-Akt and VEGF-C in tumor tissues of each group

    3 討 論

    卷曲螺旋(coiled-coil)是一種在蛋白質(zhì)中鑒定出來的特殊結(jié)構(gòu)基序。該結(jié)構(gòu)基序參與一系列生物學(xué)功能,如細(xì)胞分裂,基因表達(dá)調(diào)控,藥物傳遞和膜融合[10]。研究[10-12]表明,含有該結(jié)構(gòu)基序的蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),有望成為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及臨床判斷腫瘤治療預(yù)后的新標(biāo)志物。CCDC34是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCDC)家族的新成員之一,是與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因[5,13]。CCDC34的臨床意義首先在膀胱癌中被探索,結(jié)果表明,CCDC34在膀胱癌中表達(dá)上調(diào),通過慢病毒介導(dǎo)的sgRNA敲低CCDC34可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞周期保持在G2/M階段。此外,CCDC34的敲低顯著抑制裸鼠中膀胱腫瘤細(xì)胞的生長[3]。在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中,CCDC34差異表達(dá)水平與ESCC組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān),且CCDC34高表達(dá)的患者的總生存率(O S)和無病生存率(DFS)顯著低于CCDC34低表達(dá)的患者。因此CCDC34表達(dá)水平可作為ESCC患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素[7]。本研究首次證明CCDC34在GIST患者中與正常胃腸道黏膜組織相比高表達(dá)。然后,分析結(jié)果顯示,CCDC34表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型等無關(guān),而與腫瘤的危險度分級、腫瘤大小、腫瘤細(xì)胞核分裂象和局部侵犯、壞死和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與張著學(xué)等[14]和李小紅等[15]研究結(jié)果相似,說明CCDC34有可能參與GIST的侵襲與進(jìn)展。

    目前,已有研究[16-17]表明血管生成對腫瘤的發(fā)生,發(fā)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要??寡苌伤幬锛捌漕愃莆锏难邪l(fā)應(yīng)用,為腫瘤的治療提供了新的方法[18-20]。Qi等[8]研究表明在胰腺癌細(xì)胞中沉默CCDC34后可通過抑制PI3K/Akt信號通路阻滯腫瘤血管生成等作用。由此可以看出CCDC34參與胰腺癌血管生成。本研究為了確定在GIST中CCDC34蛋白與腫瘤血管生成之間是否存在聯(lián)系,先分析MVD和CCDC34之間的關(guān)系。與MVD計數(shù)呈正相關(guān)的結(jié)果表明,兩者具有正相關(guān)關(guān)系。這與李泓享等[21]和范曉杰等[22]研究結(jié)果相似,提示CCDC34可能通過參與了腫瘤微血管的生成。再通過動物實驗發(fā)現(xiàn),與模型組相比,CCDC34干擾組顯著降低腫瘤血管生成及PI3K、p-Akt、VEGF-C蛋白表達(dá),而CCDC34過表達(dá)組顯著提高腫瘤血管生成及PI3K、p-Akt、VEGF-C蛋白表達(dá)。本研究與前人研究[23-24]結(jié)果相似,由此表明,CCDC34調(diào)控PI3K/Akt途徑參與胃腸道間質(zhì)瘤的血管生成。其作用機(jī)制為:PI3K信號通路激活后使Akt磷酸化為p-Akt,p-Akt激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶使之磷酸化,產(chǎn)生NO刺激血管舒張和血管形成[25-27]。此外,p-Akt還可通過磷酸化IKKS,降解I-κB,激活NF-κB,從而促進(jìn)血管生成因子的表達(dá)[28-29]。

    綜上所述,在GIST中過表達(dá)CCDC34促進(jìn)的血管生成,其機(jī)制與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān),有望成為治療GIST患者的新靶點(diǎn)。但本研究所得結(jié)論只是基于裸鼠動物實驗得出,臨床中是否具有相同機(jī)制還需要進(jìn)一步探索與研究。

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