促卵泡刺激素干預(yù)對小鼠卵巢玻璃化凍存過程中bFGF 蛋白表達(dá)的影響

張旭紅，馮雪喆，郭欣欣，趙德鑫，李宇，楊文靜，陳杰

(1. 烏蘭察布市中心醫(yī)院產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

伴隨腫瘤診療技術(shù)的飛速發(fā)展，病灶早期發(fā)現(xiàn)并施以精準(zhǔn)治療，使得腫瘤患者長期存活成為可能[1]，為此，抗癌治療后患者的生活質(zhì)量成為關(guān)注焦點(diǎn)。青年及未成年女性癌癥患病率逐年上升[2]，如何避免醫(yī)源性因素造成的卵巢早衰？如何在抗癌治療過程中保護(hù)患者生育能力？是對生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提出的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

卵巢組織玻璃化凍存技術(shù)是在患者接受抗癌治療前凍存卵巢組織，待抗癌治療結(jié)束后解凍卵巢組織并回植入患者體內(nèi)，不僅沒有耽誤抗癌治療，還可有效保存生育力，提高患者生存質(zhì)量[3]。目前存在的問題是如何提高凍存效率，減少凍存過程中卵泡丟失、冰晶形成以及卵巢組織早衰等不利因素[4]。FSH 是重要的卵泡存活因子，可有效縮短凍融卵巢組織血流再灌注時(shí)間，提高凍存效率，在維護(hù)卵泡正常形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮積極作用[5]。bFGF 具有促進(jìn)增殖平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞游走的作用，是血管生成過程中重要的刺激因子，可促進(jìn)新生血管形成，對受損的內(nèi)皮細(xì)胞具有修復(fù)作用[6,7]。為此，我們擬通過觀察小鼠卵巢玻璃化凍存過程中FSH 干預(yù)性保護(hù)措施對卵泡bFGF 蛋白表達(dá)的影響，證實(shí)FSH 干預(yù)的有效性，為臨床體外凍存技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物4 周齡C57BL/6J(證號:000664)雌性小鼠，光照周期為12h 照明/12h 黑暗，室溫保持在22℃-24℃，自由取食飲水。

1.1.2 主要試劑促卵泡刺激素(FSH)

注射用重組人促卵泡刺激素(果納芬)(生產(chǎn)廠家：瑞士默克雪蘭諾制藥廠，批準(zhǔn)文號：S20080030)，人血清白蛋白(純度≥96%)(Sigma)，一抗bFGF(Abcam)為兔抗小鼠多克隆抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體的配置基液

DMEM 與F12 等比例配置。培養(yǎng)液：含12%人血清白蛋白(HSA)。預(yù)平衡液：含1.5mol/L 乙二醇。玻璃化液：EG5.5-30 玻璃化液。解凍液：分別為含0.5mol/L、0.25mol/L 以及0.125mol/L 的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的獲取采用動情間期小鼠，取完整卵巢組織并剝除被膜。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)研究目的，將卵巢組織隨機(jī)分組，每組6 枚，共分為3 組：①新鮮對照組(CG)：新鮮提取卵巢組織后，不施加任何干預(yù)直接固定、提蛋白。②玻璃化凍存對照組(VCG)：整個(gè)凍存過程無FSH 干預(yù)。③0.3IU/mL FSH 全程干預(yù)玻璃化凍存組(OG-FSH)：凍存全程添加FSH。

1.2.4 正常卵泡百分比計(jì)算[8]連續(xù)切片后進(jìn)行HE 染色，每隔5 張選取一張切片，每組取6 張切片，在高倍鏡下每張切片選取5 個(gè)高倍視野，根據(jù)卵泡形態(tài)的正常與否進(jìn)行每高倍視野(high power field,HPF)的卵泡計(jì)數(shù)。

1.2.5 bFGF 免疫組織化學(xué)觀察

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至脫水。②抗原修復(fù)。③3% H2O2室溫孵育。④山羊血清工作液封閉。⑤滴加一抗(1:100)。⑥恢復(fù)室溫，PBS 沖洗。⑦滴加二抗。⑧DAB 顯色。⑨復(fù)染。⑩封片。

1.2.6 bFGF 蛋白定量分析

①提取小鼠卵巢組織蛋白，檢測蛋白含量。②備板。③上樣。④跑膠。⑤轉(zhuǎn)膜。⑥封閉。⑦5%脫脂奶粉稀釋一抗(1:100)，4℃孵育過夜。⑧5%脫脂奶粉稀釋二抗(1:10000)。⑨暗室中顯色曝光。⑩Quantity One 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以(±s)表示計(jì)數(shù)資料、計(jì)量資料，采用單因素方差分析(One way ANOVA in Statistics)檢驗(yàn)。計(jì)算F 值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

HE 染色結(jié)果表明，VCG 組卵母細(xì)胞皺縮明顯，正常卵泡百分比各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.230，P=0.002)。其中VCG 組正常卵泡百分比顯著低于CG 組和OG-FSH 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(×400)

表1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

正常卵泡百分比/%CG(n=6 枚) 6.249±0.020 19.006±0.003 0.404±0.081 VCG(n=6 枚) 3.987±0.059 20.153±0.012 0.175±0.072★OG-FSH(n=6 枚) 8.356±0.019 18.877±0.028 0.533±0.072分組 正常卵泡數(shù)/(個(gè)/HP)卵泡總數(shù)/(個(gè)/HP)

2.2 卵巢組織bFGF 蛋白免疫組織化學(xué)法檢測

免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果顯示，bFGF 主要表達(dá)于細(xì)細(xì)胞核，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.449，P=0.000)。其中OG-FSH 組bFGF 蛋白表達(dá)量顯著高于CG 組和VCG 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2，表2。

圖2 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)結(jié)果(×400)

表2 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)IOD 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果 ( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表2 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)IOD 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果 ( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

分組 IOD 值CG(n=6 枚) 0.202±0.010 VCG(n=6 枚) 0.071±0.009 OG-FSH(n=6 枚) 0.533±0.018★

2.3 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)的western-blot 檢測結(jié)果

western-blot 檢測結(jié)果表現(xiàn)為，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.694，P=0.007)。其中VCG 組bFGF 蛋白表達(dá)量顯著低于CG 組及OG-FSH 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3，表3。

圖3 卵巢組織bFGF 蛋白western-blot 檢測結(jié)果

表3 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

表3 卵巢組織bFGF 蛋白表達(dá)結(jié)果( ±s，卵巢數(shù)n=18 枚)

注：★與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

分組 灰度值CG(n=6 枚) 0.294±0.028 VCG(n=6 枚) 0.092±0.002★OG-FSH(n=6 枚) 0.403±0.018

3 討論

目前的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法雖然實(shí)現(xiàn)了卵巢組織的快速冷凍，同時(shí)玻璃化液的滲透保護(hù)作用也大大提高了凍存效率，但卵巢組織玻璃化凍存技術(shù)在為女性癌癥患者帶來福音的同時(shí)仍然存在風(fēng)險(xiǎn)，卵泡的丟失和損傷在所難免[9]。卵巢儲備功能是女性生育力的反映[10,11]，F(xiàn)SH 在抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的同時(shí)成為重要的卵泡天然保護(hù)因子[12]。王燕蓉團(tuán)隊(duì)前期研究成果顯示[13]，小鼠卵巢玻璃化凍融過程中添加FSH 可提高卵泡存活率且縮短無血管吻合移植后的血管重建時(shí)間。bFGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞很強(qiáng)的促分裂劑和趨化因子[14]，其作為新生血管的主要調(diào)控因子[15]、特異性血管增殖因子，可通過酪氨酸酶受體(內(nèi)皮細(xì)胞中)高效作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管形成。同時(shí)，bFGF 誘導(dǎo)生成的新血管通透性高，血漿蛋白易滲透至細(xì)胞外基質(zhì)，利于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[16]。

本實(shí)驗(yàn)HE 染色的凍融卵泡形態(tài)學(xué)觀察顯示，F(xiàn)SH 在小鼠卵巢玻璃化凍存全程的保護(hù)性干預(yù)可有效提高正常卵泡百分比，在保護(hù)卵泡形態(tài)結(jié)方面效果顯著，抑制了冷凍過程冰晶形成對卵泡的結(jié)構(gòu)損傷，抑制了顆粒細(xì)胞的凋亡。OG-FSH組正常卵泡百分比顯著高于玻璃化凍存對照組，但是與新鮮對照組相比較，OG-FSH 組雖然正常卵泡百分比更高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明FSH 有效提高了凍融卵泡存活率，抑制了卵母細(xì)胞皺縮的發(fā)生，保護(hù)效果甚至達(dá)到卵泡未經(jīng)歷玻璃化凍存水平。

bFGF 蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)分析，bFGF 陽性細(xì)胞表達(dá)量IOD 值從高到低依次為：OG-FSH組、CG 組、VCG 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示，F(xiàn)SH 在玻璃化凍存的干預(yù)有效促進(jìn)了bFGF 蛋白的表達(dá)，在保護(hù)卵泡少受凍存損傷的同時(shí)可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的成活與增值，為局部受損的卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)構(gòu)建了新的血管橋梁，從而保證多數(shù)卵泡的存活與正常生長發(fā)育。bFGF 蛋白的western-blot 免疫印記結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果表達(dá)趨勢一致，表現(xiàn)為凍存全程添加FSH 的干預(yù)保護(hù)措施更有利于bFGF 蛋白的表達(dá)，充分證實(shí)bFGF 不僅在促進(jìn)新生血管發(fā)生方面效果顯著，同時(shí)存在FSH 激素依賴性。FSH 可協(xié)同bFGF 的血管保護(hù)作用，提高血管增值率，加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究顯示，F(xiàn)SH 在小鼠卵巢玻璃化凍存過程中可加速縫隙連結(jié)蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)卵泡發(fā)育過程中細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞間營養(yǎng)物質(zhì)供給。而表達(dá)于細(xì)胞核的bFGF 是否通過細(xì)胞間通訊系統(tǒng)發(fā)揮對凍融卵泡的保護(hù)和促進(jìn)作用？其是否受到細(xì)胞間縫隙連結(jié)蛋白的間接調(diào)控？需要我們進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

綜上所述，F(xiàn)SH 在玻璃化凍存過程中的保護(hù)性干預(yù)可有效促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF 的高表達(dá)，提高新生血管的發(fā)生率，間接阻止凍融過程中冰晶形成等不利因素的發(fā)生，提高凍存效率，降低凍融過程的卵泡丟失量，減少卵泡凋亡的發(fā)生，為臨床操作提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。