異型淋巴細胞比例聯(lián)合EB病毒抗體及核酸檢測在兒童傳染性單核細胞增多癥輔助診斷中的應用

陳新敏，梁 華，郭 燕，何抒蔓,葉鑫梅，張躍川，蔣 康△

1.四川省婦幼保健院·成都醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗科，四川成都 610045;2.四川省雅安市石棉縣人民醫(yī)院檢驗科，四川雅安 625400

傳染性單核細胞增多癥(IM)是一種單核-巨噬細胞系統(tǒng)增生性疾病，EB病毒(EBV)感染為其主要致病因素，兒童和青少年常見，臨床常出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、咽峽炎、淋巴結腫大等非特異性表現(xiàn)，多數(shù)預后良好，部分患者可出現(xiàn)持續(xù)高熱、肝功受損等重癥表現(xiàn)[1]。由于IM發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)多樣而復雜，臨床誤診率和漏診率較高[2]。因此，尋找用于IM早期診斷的更為靈敏而有效的方法顯得尤為重要。目前，異型淋巴細胞比例、EBV抗體及EBV核酸檢測等已在臨床實驗室開展。本研究旨在探討異型淋巴細胞比例、EBV抗體(VCA-IgM抗體)、EBV核酸(EBV-DNA)檢測聯(lián)合用于兒童IM診斷的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2020年3月于四川省婦幼保健院·成都醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院就診的兒童共185例。其中試驗組85例，年齡2～10歲、平均(5.92±3.18)歲，男48例、女37例；試驗組病例納入標準：(1)根據(jù)《諸福棠實用兒科學》第7版[3]關于兒童IM的診斷標準，確診為IM的患兒；(2)無合并其他疾??；(3)無其他特殊用藥史。排除標準：病例資料不全，影響結果分析者。對照組為同期在該院進行體檢的健康兒童，共100例，年齡1～10歲、平均(5.35±2.74)歲，男61例、女39例。本研究經該院倫理委員會批準，所有納入研究者均知情同意。兩組研究對象的性別構成、年齡、身高和體質量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組間一般資料的比較

1.2方法

1.2.1異型淋巴細胞檢測 取適量血液制成涂片，瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下鏡檢，分類100個白細胞，計算異型淋巴細胞比例。異型淋巴細胞的形態(tài)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第四版)》[4]描述的形態(tài)進行分類，判斷標準采用Downey分類方法，將異型淋巴細胞分為Ⅰ型(漿細胞型)、Ⅱ型(不規(guī)則型)和Ⅲ型(幼稚細胞型)。若異型淋巴細胞比例>10%，則判為陽性。

1.2.2VCA-IgM抗體檢測 采用化學發(fā)光法進行檢測。采集未抗凝靜脈血3 mL，自然凝固后，以3 500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，分離血清用于VCA-IgM抗體檢測。使用索林公司Liaison XL型全自動化學發(fā)光儀及其配套試劑，嚴格按說明書的操作步驟進行檢測。本室參考范圍：<20 U/mL為陰性，20～40 U/mL為可疑，>40 U/mL為陽性。

1.2.3EBV-DNA檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法進行檢測。EDTA-K2抗凝血2 mL，采用EBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒(廣東中山大學達安基因股份有限公司)，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。結果判定：測定值>1×103copy/mL判定為陽性。

2 結 果

2.1異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA的檢測 試驗組兒童的異型淋巴細胞比例為(16.31±6.95)%，陽性例數(shù)54例，而對照組兒童的異型淋巴細胞比例為(2.17±0.83)%，陽性例數(shù)6例，兩組間陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。試驗組VCA-IgM抗體和EBV-DNA檢測陽性例數(shù)分別為69例和73例，與對照組相比較，陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體、EBV-DNA檢測結果

2.2異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA單項和聯(lián)合檢測在兒童IM輔助診斷中的應用 異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA單項和聯(lián)合檢測結果顯示，3個項目聯(lián)合檢驗的靈敏度為92.94%，高于3個項目單獨檢驗的靈敏度，但特異度低于3個項目單獨檢驗，見表3。

表3 異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體、EBV-DNA單項和聯(lián)合檢測結果(%)

3 討 論

EBV是一種嗜淋巴細胞的雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，主要經唾液傳播，人群中感染率超過95%。EBV感染后可在口腔咽部上皮細胞內增殖，引起呼吸道感染，并可長期潛伏在淋巴組織中，因此，其感染具有增殖性和潛伏性的特點[5]。EBV不僅是引起IM的重要病原體，而且與某些淋巴系統(tǒng)相關的腫瘤，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、T/NK細胞淋巴瘤等的發(fā)生密切相關[6-7]。EBV感染后癥狀不典型，與其他呼吸道感染性疾病癥狀相似，臨床漏診率和誤診率均較高。

健康人體內B淋巴細胞表面存在EBV受體，當人體感染EBV，B淋巴細胞表面的EBV受體(CD21)，最先受攻擊，隨后激活T淋巴細胞，使細胞毒性T淋巴細胞演變成異型淋巴細胞[8]。因此，異型淋巴細胞比例是臨床輔助診斷IM常用的檢測指標之一，約80%的IM患者血清中可見異型淋巴細胞比例增高[9]。EBV感染后，異型淋巴細胞比例隨病程發(fā)展而變化，一般在發(fā)病初3～5 d出現(xiàn)，第7～10天達高峰后逐漸下降，持續(xù)2～8周。另外，因異型淋巴細胞由T淋巴細胞活化而來，在某種程度上反映了機體與病毒的相互作用，是臨床評價IM病情嚴重程度的指標之一。本研究結果顯示，IM患兒血清中異型淋巴細胞比例升高，為(16.31±6.95)%，陽性率為63.53%，與對照組患兒相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這也與國內學者的研究結果相似[10]。因而，異型淋巴細胞比例可作為EBV感染所致的IM的輔助診斷指標之一，其具有簡單易行，低廉快捷，適用于基層醫(yī)院，但由于異型淋巴細胞的形態(tài)識別具有主觀性，檢測者辨識能力的差異等因素，導致異型淋巴細胞比例的檢測結果重復性、可比性較差。隨著免疫學、分子生物學等檢測技術的廣泛應用，現(xiàn)已引入了EBV抗體及核酸檢測等方法用于臨床輔助診斷EBV感染所致的IM。

EBV感染機體后，B淋巴細胞可誘導機體發(fā)生體液免疫反應，產生一系列EBV抗體。原發(fā)性EBV感染時，機體首先產生對抗衣殼蛋白(CA)的IgM、IgG 抗體，即VCA-IgM、VCA-IgG抗體，其中VCA-IgM抗體最早出現(xiàn)，是急性感染期的可靠指標，其在體內持續(xù)1～2個月后逐漸消除，VCA-IgG抗體出現(xiàn)晚于VCA-IgM，急性感染晚期機體會出現(xiàn)抗早期抗原(EA)的抗體，恢復期會出現(xiàn)晚期抗核抗原(NA)的抗體，VCA-IgG、病毒中和抗體(VNA-IgG)在體內會持續(xù)存在[11]。鑒于EBV潛伏感染的特點及機體抗體產生的規(guī)律，臨床上多以VCA-IgM陽性作為EBV感染所致IM輔助診斷的依據(jù)。本研究采用血清VCA-IgM抗體檢測，研究結果也發(fā)現(xiàn)，69例已確診為IM的患兒VCA-IgM抗體檢測為陽性，有16例[18.82%(16/85)]的患兒抗體檢測為陰性，這與兒童免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育或處于病毒感染初期，機體感染病毒后，無法產生抗體或抗體量太低，導致血清學檢測出現(xiàn)假陰性結果[12]。

隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展，臨床現(xiàn)已引入了熒光定量PCR檢測EBV-DNA，通過定量檢測患兒血清EBV-DNA水平反映體內病毒感染和復制情況[13]。該檢測項目對IM的輔助診斷和療效評估都具有重要意義。本研究結果顯示，EBV-DNA檢測的陽性率為85.88%，高于異型淋巴細胞比例和血清學抗體檢測陽性率，這與CAO等[14]的研究結果相似。

由于IM起病隱匿，且與其他急性呼吸道感染性疾病的癥狀相似，臨床易出現(xiàn)漏診和誤診，因此有必要尋求針對兒童IM及時而有效的輔助診斷方法。目前，臨床常用異型淋巴細胞比例、EBV抗體及核酸檢測這3種檢測方法來輔助診斷IM。本研究結果顯示，3種方法聯(lián)合檢測診斷IM的靈敏度為92.94%，高于3種方法單獨檢測結果，與國內學者的研究結果較一致[15]。

因此，有條件的實驗室，應將異型淋巴細胞比例、VCA-IgM抗體檢測及EBV-DNA檢測3個項目均開展，并進行聯(lián)合檢測，以提高輔助診斷IM的靈敏度，彌補單項試驗的不足，降低漏診率和誤診率。