微生物法檢測乳粉中葉酸的優(yōu)化研究

文/蘇妙儀 嚴家俊 張 娟

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院）

維生素是人體神經(jīng)系統(tǒng)最重要的營養(yǎng)素，包括維生素A、B、D、E等，其中B族維生素又是重要的神經(jīng)營養(yǎng)類維生素。如果長期缺乏某種維生素，就會引起生理機能障礙而發(fā)生某種疾病。維生素攝入可能降低肝癌的發(fā)病風險，特別是維生素E和葉酸的效果更顯著[1]。葉酸屬于水溶性B族維生素，通常儲存于綠葉蔬菜、水果及動物肝臟中，在蛋白質(zhì)代謝、維持人體機能等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[2]。歐盟建議成年人每日葉酸推薦攝入量為400 μg，孕期和哺乳期婦女每日葉酸推薦攝入量為400～600 μg。我國食品安全國家標準對嬰幼兒配方乳粉中強化維生素的含量有嚴格要求，對于嬰兒葉酸含量一般要求在2.5～12.0 μg/100 kJ之間，較大嬰兒和幼兒最低含量為1 μg/100 kJ[3，4]。葉酸能夠促進嬰兒身體器官的發(fā)育，增加嬰兒的免疫力等。因此，育齡期女性合理補充葉酸，是促進優(yōu)生優(yōu)育的重要措施[5]。研究表明，葉酸攝入量不足或代謝通路受阻會增加腦卒中的發(fā)病風險[6]，葉酸水平低可能是阿爾茲海默病發(fā)生的危險因素[7]，維持較好的葉酸水平對降低高血壓、預(yù)防和控制心腦血管疾病具有重要意義[8]。因此食品中葉酸含量的準確測定十分關(guān)鍵，對指導人們?nèi)粘ｏ嬍场㈩A(yù)防疾病具有重要意義。

目前，葉酸的檢測方法主要包括色譜法[9～13]、熒光法[14～17]、微生物法[18～19]、電化學法[20]和酶聯(lián)免疫法[21，22]等。在眾多檢測方法中，微生物法由于靈敏度高、不需要復雜設(shè)備儀器及成本低等優(yōu)點[25]，在最新的第十七版官方分析化學家協(xié)會AOAC（Association of Official Analytical Chemists）和美國谷物化學家協(xié)會分析方法中，被列為食品葉酸的第一分析方法，其定量分析原理為微生物生長需要生長因子，而葉酸是鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus caseisub sp. Rhamnosus ATCC7469）生長所必需的因子，并具有專一性。在一定條件下，鼠李糖乳酸桿菌的生長繁殖速度與溶液中葉酸的含量成正比關(guān)系，從而定量計算出葉酸的含量。但是微生物法也存在試驗周期長，步驟繁瑣，對試驗人員和試驗室的要求較高，結(jié)果重復性差等局限性。因此本文在GB 5009.211-2014基礎(chǔ)上，對菌株冷凍制備保存，菌懸液濃度以及培養(yǎng)時間進行摸索，以縮短接種液制備時間，從而縮短整個試驗周期，以應(yīng)對日益增長的檢測需求，對促進嬰幼兒乳粉中葉酸含量的研究具有一定的指導意義。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品：5 組嬰幼兒配方乳粉，隨機購于各大超市；SRM 1849a質(zhì)控樣品購于美國NIST。

試驗菌株：鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus caseispp.rhamnosus）ATCC7469，購于環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器試劑

儀器：AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；UV-1900紫外可見分光光度計，島津（中國）有限公司。

試劑：葉酸測定用培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葉酸標準品，購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；相關(guān)標準溶液的配制參照GB 5009.211-2014。

1.3 試驗方法

1.3.1 接種液優(yōu)化

將鼠李糖乳酸桿菌凍干粉接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基上，（37±1）℃培養(yǎng)20～24 h。再轉(zhuǎn)種2 ～3 代增強活力。將活化后的菌液以8000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻。重復洗脫3次，確保無殘留培養(yǎng)基。預(yù)先用50 mL含有25%甘油的葉酸測定用培養(yǎng)基混勻制成菌懸液并分裝1.0mL至菌株保存管，-70 ℃凍存?zhèn)溆?。每次試驗前?70℃冰箱中取出適量的菌株儲備液，充分混勻。

1.3.2 適宜菌懸液濃度與培養(yǎng)時間的探索試驗

使用0.85%生理鹽水對同一批次制成的菌株儲備液進行稀釋，調(diào)節(jié)透光率成4 種濃度測試菌液：30%、50%、70%、90%，分別加入50 μL到葉酸含量為0.00 ng和1.00 ng的試管中，一式三份。培養(yǎng)16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h和60 h，同時以葉酸含量為0.00ng作為空白對照管，540 nm下分別測定其余試管的吸光度，比較各濃度測試菌懸液的生長規(guī)律。

1.3.3 試樣制備方法的優(yōu)化[23]

試樣的制備方法參考G B 5009.211-2014并進行優(yōu)化，取試樣約1.0 g至50 mL離心管中，加入約30 mL純水，搖勻，定容至40 mL。95 ℃水浴30 min，其間振蕩至少5 次，迅速冷卻至室溫，使用0.22 μm 濾膜過濾除菌后，稀釋相應(yīng)倍數(shù)，使葉酸稀釋液濃度落在標準曲線范圍內(nèi)，備用。

1.3.4 準確性試驗

以SRM 1849a質(zhì)控樣品中葉酸含量為基準，按1.3.3試樣制備的優(yōu)化方法處理試樣，并采用1.3.2試驗所得的最適菌懸液濃度和培養(yǎng)時間的關(guān)系，進行6 次平行試驗。同時與國標微生物法的測定結(jié)果進行比較。

1.3.5 重復性試驗

隨機選取5 組嬰幼兒配方乳粉，按1.3.3試樣制備的優(yōu)化方法處理試樣，并采用1.3.2試驗所得的最適菌懸液濃度和培養(yǎng)時間的關(guān)系對每個試樣進行6 次重復性試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜菌懸液濃度與培養(yǎng)時間關(guān)系的確定

以測定試管的培養(yǎng)時間為橫坐標，不同時間測得的吸光度值為縱坐標，繪制不同濃度測試菌液的生長曲線，見圖1～4。

由圖1～4結(jié)果可知，營養(yǎng)物充足的情況下，隨著透光率的降低，菌懸液濃度增大，菌體進入穩(wěn)定生長期越快，時間越短。圖1試管由于菌懸液濃度低，適應(yīng)期較長，在培養(yǎng)16～36 h之間處于適應(yīng)調(diào)整期，生長緩慢，吸光度值從0.098到0.298變化較小，測得吸光度值較圖2、3、4試管明顯偏低；圖2試管菌體經(jīng)過一段時期適應(yīng)后在16～40 h之間以最快的速度進行繁殖進入對數(shù)期，吸光度值變化明顯，在該時期內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的濃度影響菌的生長速率和總生長量，在40 h之后增速緩慢，到60h測得吸光度值無明顯變化，處于穩(wěn)定生長期；圖3、4試管由于菌懸液濃度較高，短時間內(nèi)16 h分別測得吸光度值0.686和0.759，直接處于對數(shù)生長期，且兩組試管分別在36 h和28 h進入穩(wěn)定期，到60 h之后增速緩慢，測得吸光度值無明顯變化。

圖1 透光率90%濃度的測試菌懸液生長曲線

圖2 透光率70%濃度的測試菌懸液生長曲線

圖3 透光率50%濃度的測試菌懸液生長曲線

圖4 透光率30%濃度的測試菌懸液生長曲線

從該試驗結(jié)果得知，圖2、3、4試管由于菌懸液濃度的逐步增大，菌體進入穩(wěn)定生長期時間越短，分別在40 h、36 h和28 h進入穩(wěn)定生長期，當生長因子葉酸耗盡，鼠李糖乳酸桿菌停止增長，不管培養(yǎng)時間的延長，測得吸光度值無明顯變化，因此可以利用終點法測定葉酸的含量。試驗中還發(fā)現(xiàn)，由于標準系列管中低濃度葉酸含量很低，如果菌懸液濃度較高（圖3、4 試管），會在短時間內(nèi)進入對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期甚至是衰老期，從而導致鼠李糖乳酸桿菌在標準系列管中均處于不同生長期，測得吸光度值有變化，最終影響試驗結(jié)果。因此本次試驗結(jié)果表明，該批次菌株儲備液用于葉酸測定時，將測定菌懸液透光率稀釋在70%、培養(yǎng)時間在40 h以上可以保證試驗的可行性與穩(wěn)定性。

2.2 接種液優(yōu)化

GB 5009.211-2014中接種液的制備：先將儲備菌株連續(xù)傳種2～3 代以保證細菌活力（耗時3～4天）并且每月至少傳代1 次。試驗前活化后的菌株再接種至瓊脂培養(yǎng)基中（37±1）℃培養(yǎng)20～24 h后，備用。然后試驗前一天，取2 mL葉酸標準工作溶液和4 mL葉酸測定用培養(yǎng)液混勻，分裝于2 支5 mL離心管中，塞好棉塞，于121 ℃高壓滅菌15 min后即為種子培養(yǎng)液。冷卻后用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)至2支種子培養(yǎng)液中，于（37±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。試驗當天取出后將種子培養(yǎng)液混懸，無菌操作下用無菌注射器吸取0.5 mL轉(zhuǎn)接至另兩支已消毒但不含葉酸的培養(yǎng)液中，于（37±1） ℃培養(yǎng)6 h，振蕩混勻，制成接種液，立即使用。完成接種液制備，整個過程需要耗時4～5 天，操作繁瑣，制備時間長，并且由于菌株代數(shù)不同，活力不同，導致濃度也不易把握。再加上試驗培養(yǎng)時間和最終吸光度測定，完成一批樣品檢測總耗時6～7天。檢驗時間過長，不利于大批量、任務(wù)緊急的檢測。

圖5 標準曲線-國標微生物法

圖6 標準曲線-優(yōu)化方法

本研究方法是將活力增強2～3代后的菌株預(yù)先用50 mL含有25%甘油的葉酸測定用培養(yǎng)基混勻制成菌懸液并分裝1.0mL至菌株保存管，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｃ看卧囼灂r只需要拿出該批次菌株儲備液一支，凍融后，用0.85%生理鹽水稀釋至測定菌懸液透光率在70%可直接作為接種液使用，試驗當天可完成，節(jié)省了接種液的制備時間。其中甘油作為防凍劑防止冰晶對細胞造成傷害。

2.3 標準曲線比較

確定該批次菌株儲備液適宜的菌懸液濃度為透光率T=70%、培養(yǎng)時間在40h以上，比較國標微生物法和優(yōu)化方法所作標準曲線的差異，結(jié)果見圖5、6。

由圖5和圖6結(jié)果可知，兩種方法標準曲線線性關(guān)系較好，效果相當，R2值可達到0.99以上。國標微生物法是將試驗用菌濃度和培養(yǎng)時間限定在一定范圍內(nèi)，但由于菌的生長規(guī)律存在一定的偏差，不同代數(shù)的菌株活力不同，因此使用相同菌濃度和培養(yǎng)時間往往不適用于不同代數(shù)的菌株生長，易造成結(jié)果不穩(wěn)定。而優(yōu)化方法固定同一批次菌株儲備液的菌懸液濃度為T=70%、接種量50 μL、37 ℃培養(yǎng)40 h以上，基本確保同一批次菌株的活力從而保證試驗的穩(wěn)定性。

2.4 準確性與重復性試驗比較

本研究擬對樣品進行簡單的水浴提取、稀釋，優(yōu)化樣品的提取步驟，結(jié)合菌株制備的優(yōu)化方法，對微生物法測定葉酸的含量進行優(yōu)化，并將優(yōu)化方法應(yīng)用于檢測嬰幼兒乳粉中葉酸的含量。以質(zhì)控樣品SRM 1849a為基準，使用優(yōu)化方法處理樣品，并選擇最適菌濃度和培養(yǎng)時間進行6 次試驗，比較優(yōu)化方法與國標微生物法所測得結(jié)果的差異，結(jié)果見表1；同時，選取了5 種不同的嬰幼兒配方乳粉樣品，使用優(yōu)化方法對每個樣品進行6 次重復性試驗，結(jié)果見表2。以此對優(yōu)化方法進行驗證，為縮短檢驗周期，提高試驗效率。

由表1結(jié)果可知，兩種方法所測結(jié)果都與SRM 1849a中葉酸含量為229.3±6.2 ug/100 g標示值相符，準確性良好。相對于國標微生物法，優(yōu)化方法結(jié)果更準確，6 次平行試驗的相對標準偏差RSD較小，可達1.61%。由表2結(jié)果可知，5組不同嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的RSD分別為1.74%、3.67%、4.36%、5.85%和4.00%。表明該方法重復性良好。

3 總結(jié)

GB 5009.211-2014微生物法檢測嬰幼兒乳粉中葉酸含量從菌種制備、試樣提取到接種培養(yǎng)等步驟繁瑣、復雜，存在易受外部因素干擾等問題，導致試驗周期長，結(jié)果穩(wěn)定性、重現(xiàn)性差。而微生物法測定維生素的關(guān)鍵因素是試驗菌株，多次傳代易造成菌株活力不同從而導致試驗穩(wěn)定性不可控。本研究在GB 5009.211-2014基礎(chǔ)上作了兩點優(yōu)化：（1）優(yōu)化接種液制備，菌株儲備液預(yù)先分裝到菌株保存管中，通過比較菌株的生長規(guī)律，得出該批次菌株儲備液的適宜濃度和培養(yǎng)時間，確保同一批次的菌株活力基本一致，可以有效控制試驗中接種液的濃度、添加量和培養(yǎng)時間。達到制備一次菌液可多次使用的目的。由原來的6～7 天縮減至2～3天，既節(jié)省了每次試驗制備接種液時間，實現(xiàn)來樣當天檢測，又保證了試驗的穩(wěn)定有效。（2）試樣提取，國標微生物法中對于嬰幼兒乳粉可采用直接提取法，但是也需要加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，超聲振蕩2～4 h，至試樣完全溶解或分散，然后用水定容至刻度等步驟。本研究表明，嬰幼兒乳粉直接用純水定容，經(jīng)95 ℃水浴30 min提取稀釋后可直接檢測葉酸，縮短了試樣制備需要超聲2～4 h。

綜上所述，本文對關(guān)鍵試驗條件優(yōu)化研究，解決了接種液制備耗時長的問題；簡化試樣提取步驟，從而簡便了操作流程，縮短了檢驗周期，減少多方面的干擾，具有良好的準確性和重復性，保證了試驗的穩(wěn)定有效。該優(yōu)化方法提高工作效率，降低檢驗成本，適合在實驗室推廣和使用，對實驗室開展微生物法檢測乳粉中葉酸的含量具有一定的指導意義。