王治會(huì),彭 華,楊普香,*,江新鳳,李文金,岳翠男,李 琛,李延升
(1.江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330202;2.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所 ,江西 南昌 330202)
白化、黃化茶樹屬于茶樹中的珍稀資源,是一類代謝機(jī)制特異的葉色突變體[1-2]。用此類葉色突變體為原料制作的茶產(chǎn)品,因形美香高、滋味鮮爽、苦澀味低而受到消費(fèi)者青睞,使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高,已成為各地茶企茶農(nóng)增收的重要途徑[3]。黃金菊為黃化茶樹品種中的一種,是20世紀(jì)80年代江西省修水縣茶葉科學(xué)研究所科研人員從寧州群體種中經(jīng)單株優(yōu)選培育而成,嫩梢芽葉呈黃色,似菊花而得名[4];后引種到贛中丘陵地區(qū)江西省蠶桑茶葉研究所,未因地理環(huán)境不同而改變其特性[5]。江西省蠶桑茶葉研究所科研人員將黃金菊自然雜交的種子播種之后,萌發(fā)率高,且其實(shí)生苗單株表型差異性極大,芽葉色澤與葉片性狀多樣,為葉色特異資源篩選提供了另外一種可能性,且極具篩選優(yōu)異單株的潛力。
自然雜交指的是近期或者歷史上自然發(fā)生的沒有受到人為因素干擾的物種雜交事件,是植物物種形成的主要驅(qū)動(dòng)力[6],不僅可以增加遺傳多樣性和物種的適應(yīng)性,而且可以導(dǎo)致物種的輻射式演化,促進(jìn)大量物種在相對(duì)較短的時(shí)期內(nèi)形成,也可增加物種對(duì)植食作用、病原體和寄生蟲壓力的抗性,在應(yīng)對(duì)氣候劇變、蟲害爆發(fā)、病原菌等環(huán)境壓力時(shí),可能會(huì)表現(xiàn)更出色[7-9]。沈紅香等[10]對(duì)王族觀賞海棠的自然雜交遺傳多樣性進(jìn)行研究,結(jié)果表明,其在形態(tài)和分子遺傳水平上都具有豐富的多樣性,尤其在形態(tài)上的差異更為顯著,這些變異為觀賞海棠的品種育種提供了良好材料。王玉等[11]的研究結(jié)果表明,玫瑰自然雜交后代的遺傳多樣性豐富,親本來源的多樣性使得玫瑰的分類體系增加了2個(gè)類系,為培育玫瑰新品種提供材料與依據(jù)。趙麗娜等[12]對(duì)藍(lán)莓的自然雜交品系進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),從中篩選到了5個(gè)優(yōu)良品系。范凱等[13]研究表明,茶樹黃山種自然雜交后代發(fā)生了基因的分離和重組,產(chǎn)生了豐富的遺傳變異,部分單株一芽三葉長(zhǎng)、百芽質(zhì)量較大,為后續(xù)系統(tǒng)選種提供了優(yōu)異種質(zhì)材料。楊軍等[14]對(duì)茶樹6個(gè)自然雜交群體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)各群體遺傳多樣性差異不同,福云6號(hào)最高,白雞冠、悅茗香、紫玫瑰相當(dāng),金觀音、金牡丹次之。本研究以前期標(biāo)記的17份芽葉性狀表現(xiàn)較好的黃金菊自然雜交單株為材料,鑒定其23項(xiàng)表型性狀,分析其表型變異與Shannon-Weaver多樣性,從中篩選表型優(yōu)良單株,分析其生化成分差異,最終利用主成分分析進(jìn)行生化品質(zhì)評(píng)價(jià)。以期明確黃金菊自然雜交單株的表型變異與多樣性,從中篩選優(yōu)良單株,為進(jìn)一步探索其自然雜交后表型變異的分子機(jī)理與開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
2013年秋季,從黃化變異茶樹品種黃金菊母株上采集種子,母株周邊均為國(guó)內(nèi)各區(qū)域茶樹種質(zhì)資源,位于江西省蠶桑茶葉研究所茶樹品種園內(nèi)。2014年春季進(jìn)行播種,2017—2018年從中標(biāo)記17份芽葉性狀表現(xiàn)較好的單株,見圖1。2018—2020年連續(xù)3 a對(duì)標(biāo)記單株進(jìn)行表型性狀鑒定與生化成分分析,生化樣品為春季采摘各單株一芽二葉鮮葉,采用微波殺青,然后于80 ℃烘干固樣。
1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品
咖啡堿、沒食子酸(GA)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和兒茶素(C)等標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98%,購(gòu)買于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。
1.2.1 表型性狀鑒定
參考《NY/T 2422—2013 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 茶樹》,測(cè)定黃金菊生長(zhǎng)勢(shì),結(jié)果為中等。以黃金菊為標(biāo)準(zhǔn)品種,比其生長(zhǎng)勢(shì)差的標(biāo)記為弱,比其生長(zhǎng)勢(shì)好的標(biāo)記為強(qiáng);物候期測(cè)定以福鼎大白茶為對(duì)照,在春季固定觀察單株越冬頂芽,當(dāng)有三分之一達(dá)到一芽一葉時(shí),即為此單株的一芽一葉期。一芽一葉期與福鼎大白茶相差在5 d之內(nèi)的物候期為早,比福鼎大白茶晚5~10 d的為中,晚10 d以上的為晚;樹型、樹姿、葉片大小、葉片著生狀態(tài)、葉形、葉色、葉基、葉身、葉尖、葉面、葉緣、葉質(zhì)、葉齒形態(tài)、芽葉茸毛、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積、葉脈對(duì)數(shù)、單芽長(zhǎng)、一芽二葉長(zhǎng)等測(cè)定參考《NY/T 1312—2007 農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程 茶樹》;芽葉色澤為實(shí)際觀察到的色澤。
1.2.2 生化成分測(cè)定
咖啡堿、兒茶素組分(GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG)含量測(cè)定采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相A為3‰冰乙酸溶液,流動(dòng)相B為純乙腈。流動(dòng)相A:0~5 min為95%~92%,5~15 min為92%~88%,15~30 min為88%~80%,30~31 min為88%~0%,31~35 min為0%;流動(dòng)相B:0~5 min為5%~8%,5~15 min為8%~12%,15~30 min為12%~20%,30~31 min為20%~100%,31~35 min為100%。進(jìn)樣量為10 μL,柱溫為35 ℃,流速為1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。茶多酚含量測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018,游離氨基酸含量測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314—2013,水浸出物含量測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8305—2013。每個(gè)樣品測(cè)定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。酚氨比=茶多酚含量/游離氨基酸含量,兒茶素苦澀味指數(shù)=(EGCG+ECG+EGC+GC)/(EC+C)。
在對(duì)表型性狀中的描述型性狀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí),先對(duì)各性狀的描述等級(jí)進(jìn)行賦值,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表型性狀Shannon-Weaver多樣性指數(shù)=-ΣXj×lnXj,Xj是某生化成分第j個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的頻率。
級(jí)別劃分利用各性狀指標(biāo)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分為10級(jí):第1級(jí)為Y1<(-2θ),第10級(jí)為Y10≥(+2θ)。其中,為各性狀指標(biāo)的平均數(shù),θ為各性狀指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差,每0.5θ為1級(jí)。數(shù)據(jù)描述性統(tǒng)計(jì)、LSD方差分析采用軟件SPSS 19.0,柱狀圖制作采用Excel 2016,主成分分析、變異系數(shù)與多樣性指數(shù)的分布圖制作采用軟件Origin 2018。
17份自然雜交后代單株的描述型性狀統(tǒng)計(jì)見表1,描述型性狀的變異系數(shù)與多樣性分布見圖2。變異系數(shù)范圍為0%~57.23%,均值為33.88%。從圖2的變異系數(shù)分布圖中可以看出,存在2個(gè)離群點(diǎn),分別為樹型和樹姿,它們的變異系數(shù)均為0,說明經(jīng)過自然雜交之后,其后代在樹型與樹姿2個(gè)性狀上沒有發(fā)生變異,樹型均為灌木型,樹姿均為開張。其他性狀的變異較大,且分布較為均勻,變異系數(shù)高于均值的性狀依次為芽葉色澤、芽葉茸毛、葉緣、物候期、葉質(zhì)、葉面、生長(zhǎng)勢(shì)、葉齒形態(tài)、葉色、葉片大小。多樣性指數(shù)范圍為0~1.78,均值為0.81;從多樣性指數(shù)分布圖上來看,存在3個(gè)離群點(diǎn),分別是樹型、樹姿和芽葉色澤,因樹型和樹姿這2個(gè)性狀未發(fā)生變異,所以不存在多樣性;芽葉色澤的多樣性明顯高于其他性狀,主要原因在于芽葉色澤的變異系數(shù)最大,變異程度最高,所以自然雜交后代中產(chǎn)生了豐富的多樣性,多樣性指數(shù)高于均值的性狀依次為芽葉色澤、葉色、生長(zhǎng)勢(shì)、物候期、葉尖、葉質(zhì)、葉面、葉緣、葉齒形態(tài)、芽葉茸毛。江西省茶樹種質(zhì)資源的表型多樣性均值為0.9,變異系數(shù)為35.32%[15]。與本研究相比,黃金菊自然雜交后代的變異系數(shù)與多樣性稍低,但相差不大,由此說明黃金菊自然雜交后代的多樣性極其豐富,遺傳改良潛力巨大。
表1 描述型性狀的描述性統(tǒng)計(jì)Table 1 Descriptive statistics of descriptive traits
黃金菊自然雜交后代的芽葉色澤極其多樣化,包括8種,黃金菊本身為黃化變異品種,經(jīng)過自然雜交之后,其顏色變異更加豐富,維持了母株芽葉黃色的有3株,淺黃色1株,紫黃色1株,紫色1株,綠色系列11株。葉片大小有2種類型,包括中葉和小葉,以小葉形為主,占比76%。葉片著生狀態(tài)以上斜為主;葉形包括近圓形、橢圓形、長(zhǎng)橢圓形這3種,以橢圓形為主,占比65%。葉色較為多樣化,包括深綠、綠、淺綠和黃綠這4種。葉基有2種,主要為近圓形。葉身主要為內(nèi)折。葉尖主要為漸尖,葉面主要為微隆起和平。葉緣主要為平。葉質(zhì)主要為中和柔軟。葉齒形態(tài)主要為鋸齒形和少齒形。芽葉茸毛主要為少。生長(zhǎng)勢(shì)和物候期是茶樹品種選育所關(guān)注的主要性狀,生長(zhǎng)勢(shì)決定了茶樹成活之后的生長(zhǎng)能力,生長(zhǎng)勢(shì)越強(qiáng),茶樹的育芽能力越強(qiáng),往往適應(yīng)性越強(qiáng)。物候期與春茶上市時(shí)間息息相關(guān),春茶上市時(shí)間越早,其經(jīng)濟(jì)價(jià)值越大。所以在資源篩選時(shí),一般選擇生長(zhǎng)勢(shì)較好和物候期較早的茶樹品系[16-17]。黃金菊自然雜交后代中生長(zhǎng)勢(shì)達(dá)到強(qiáng)的有5個(gè)單株,占比29%,達(dá)到中的有7株,占比41%;物候期達(dá)到早的有4個(gè)單株,占比24%,達(dá)到中的有6株,占比35%。黃金菊母株的生長(zhǎng)勢(shì)為中,物候期為晚;在自然雜交后代中有7份生長(zhǎng)勢(shì)和物候期均在中等以上,分別為HJJ-1、HJJ-7、HJJ-9、HJJ-11、HJJ-12、HJJ-14和HJJ-17,這7份單株的表型性狀表現(xiàn)較好。
數(shù)量型性狀的描述統(tǒng)計(jì)見表2,變異系數(shù)與多樣性指數(shù)分布見圖3,數(shù)量型性狀的變異系數(shù)范圍為10.33%~19.82%,均值為14.68%;從分布圖上來看,沒有離群點(diǎn),呈兩極分散,葉面積、單芽長(zhǎng)和一芽二葉長(zhǎng)變異較大,葉長(zhǎng)、葉寬和葉脈對(duì)數(shù)變異較小。多樣性指數(shù)范圍為1.14~1.95,均值為1.75;從分布圖上可以看出存在1個(gè)離群點(diǎn),為葉脈對(duì)數(shù),其他性狀分布集中。葉脈對(duì)數(shù)的變異較小,其多樣性程度最低。
表2 黃金菊自然雜交后代數(shù)量型性狀的描述性統(tǒng)計(jì)Table 2 Descriptive statistics of quantitative traits in natural hybrid progenies of Huangjinju
通過對(duì)黃金菊自然雜交單株的物候期和生長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行分析,篩選出7份表現(xiàn)較好的單株,其主要生化成分和LSD方差分析結(jié)果見表3。水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質(zhì)的重要次生代謝物質(zhì)[18]。水浸出物含量影響茶湯濃度,其含量范圍為35.67%~44.84%,HJJ-9、HJJ-14和HJJ-17的水浸出物含量與黃金菊無顯著性差異(P>0.05),另外4份單株的水浸出物含量顯著低于黃金菊。游離氨基酸是茶湯鮮爽味的重要貢獻(xiàn)成分,也是茶葉香氣形成的關(guān)鍵因子,含量越高,茶葉品質(zhì)越好[19]。7份單株中游離氨基酸含量范圍為3.34%~4.47%,有6份高于黃金菊,HJJ-9、HJJ-12和HJJ-14的游離氨基酸含量顯著(P<0.05)高于黃金菊??Х葔A是茶湯苦味的主要貢獻(xiàn)成分,也影響茶樹的抗蟲性與抗病性[19],其含量范圍為4.07%~4.66%,7份單株的咖啡堿含量均與黃金菊無顯著(P>0.05)差異,說明黃金菊自然雜交后代中咖啡堿含量無明顯變化。茶多酚對(duì)茶湯的苦澀味、色澤等有重要貢獻(xiàn),同時(shí)也影響茶樹的抗蟲性和抗病性[19],其含量范圍為15.32%~21.39%,除HJJ-9外,其他6個(gè)單株的茶多酚含量均顯著(P<0.05)低于黃金菊。酚氨比對(duì)茶葉適制性有參考意義,一般認(rèn)為比值高的茶葉適制紅茶,低的適制綠茶[20-21]。7份單株的酚氨比范圍為3.46~5.20,均顯著(P<0.05)低于黃金菊。
表3 黃金菊自然雜交后代主要生化成分的差異分析Table 3 Difference analysis of main biochemical components in natural hybrid progenies of Huangjinju
續(xù)表3 Continued Table 3
兒茶素對(duì)茶湯的苦澀味有重要貢獻(xiàn),包括簡(jiǎn)單兒茶素和酯型兒茶素,兒茶素苦澀味指數(shù)越大,苦澀味越重,能夠在一定程度上反映兒茶素品質(zhì)[22-24]。7份單株的總兒茶素含量為11.67%~17.71%,均顯著(P<0.05)低于黃金菊。酯型兒茶素的變化趨勢(shì)與總兒茶素相同;而簡(jiǎn)單兒茶素的變化趨勢(shì)與總兒茶素相反,7份單株中有6份高于黃金菊,其中4份顯著(P<0.05)高于黃金菊。苦澀味指數(shù)范圍為4.69~10.72,除HJJ-14外,其他6份單株的苦澀味指數(shù)顯著(P<0.05)低于黃金菊。
從上述生化成分分析可以看出,黃金菊在自然雜交之后,除咖啡堿在各單株中無顯著差異之外,其他各成分之間均有顯著差異。自然雜交后代部分單株的游離氨基酸和簡(jiǎn)單兒茶素含量顯著(P<0.05)提高;茶多酚、總兒茶素、酯型兒茶素含量,以及酚氨比和苦澀味指數(shù)顯著(P<0.05)降低。這些改變對(duì)茶樹鮮葉制茶品質(zhì)提升具有重要作用,說明能夠從這些自然雜交后代中篩選出生化成分優(yōu)良的單株。
《非主要農(nóng)作物品種登記指南 茶樹》中以水浸出物、茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿作為茶樹品種品質(zhì)分析的主要成分。兒茶素苦澀味指數(shù)能夠體現(xiàn)兒茶素品質(zhì)[22],所以本研究以水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿和兒茶素苦澀味指數(shù)為變量,采用主成分分析對(duì)篩選的7份表型性狀較好的單株進(jìn)行生化成分綜合評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)結(jié)果見圖4。提取的前2個(gè)主成分能夠解釋85.5%的變異,說明模型的解釋度較高。最終建立的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)模型為Y=0.69PC1+0.31PC2(PC1和PC2分別代表第一主成分和第二主成分的線性模型)。從載荷圖上可以看出各生化成分分散在4個(gè)不同的象限內(nèi),說明采用的5個(gè)變量相互之間的信息重疊較少,具有代表性。從圖4可以看出,HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17這5份單株的評(píng)價(jià)結(jié)果比黃金菊好,HJJ-9和HJJ-14比黃金菊差,說明HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17這5份單株的表型與生化品質(zhì)均較好,可以進(jìn)一步進(jìn)行扦插繁育,形成系列新品系。江新鳳等[5]的研究表明,黃金菊適合制作綠茶。通過各單株的酚氨比可以初步判斷其適制性,黃金菊的酚氨比為6.51,所篩選的這5份單株的酚氨比均在5.2以下,初步判斷均適合制作綠茶。HJJ-12的特征為芽葉綠色,生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),物候期早,游離氨基酸含量高,茶多酚含量低;HJJ-1的特征為芽葉深綠色,生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),物候期早,咖啡堿含量低;HJJ-7的特征為芽葉黃色,生長(zhǎng)勢(shì)中,物候期中,茶多酚含量低;HJJ-11的特征為芽葉黃色,生長(zhǎng)勢(shì)中等,物候期早,酚氨比低;HJJ-17的特征為芽葉紫色,生長(zhǎng)勢(shì)中等,物候期中,水浸出物含量高。
17份黃金菊自然雜交單株的表型性狀中樹型與樹姿無變異,也無多樣性,其他表型性狀變異較大且多樣性豐富,其中以芽葉色澤、芽葉茸毛、物候期、生長(zhǎng)勢(shì)和部分葉片性狀的變異較大。篩選出7份表型優(yōu)良單株,其生化成分中咖啡堿含量無顯著差異,其他成分差異顯著;與黃金菊相比,部分自然雜交單株的游離氨基酸和簡(jiǎn)單兒茶素含量顯著提升,而茶多酚、總兒茶素、酯型兒茶素含量顯著下降。最終篩選出了5份表型與生化品質(zhì)較好的單株,初步判斷它們均適合制作綠茶,各單株具有典型特征;其中,HJJ-12和HJJ-1芽葉為綠色,HJJ-7和HJJ-11芽葉為黃色,HJJ-17芽葉為紫色。特異性(芽葉顏色、功能成分等)茶樹資源發(fā)掘是茶樹品種選育工作的重點(diǎn),通過對(duì)黃化品種黃金菊自然雜交后代的表型變異與多樣性的研究,能夠初步看到變異茶樹品種經(jīng)過雜交之后,能夠產(chǎn)生更加多樣化的種質(zhì),所以以變異的白化、黃化、紅芽和紫芽等特異品種為親本進(jìn)行雜交,可以作為一種種質(zhì)創(chuàng)新的途徑。另外,本研究?jī)H對(duì)表型性狀和部分生化成分進(jìn)行了鑒定,產(chǎn)生表型變異和多樣性的原因之一為功能基因的表達(dá)差異,進(jìn)一步的研究將集中在探索其產(chǎn)生變異的分子機(jī)理。