我國特色發(fā)酵蔬菜降解亞硝酸鹽菌株的篩選鑒定及應(yīng)用

忻曉庭，劉大群，張程程，吳 敏，陳登高，章檢明，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 食品科學研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310021；2.浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058；3.浙江三統(tǒng)菜業(yè)有限公司，浙江 紹興 312000)

我國是蔬菜第一生產(chǎn)大國，近年來為解決我國新鮮蔬菜浪費嚴重的問題，許多對蔬菜發(fā)酵方面的研究應(yīng)運而生[1-3]。發(fā)酵蔬菜種類繁多，包括醬腌菜、泡菜、酸菜等，市面上常見的有四川泡菜、東北酸菜、榨菜、雪菜、酸豆角等。發(fā)酵蔬菜酸鮮可口，香味濃郁，開胃下飯，是人們離不開的日常小菜[4-5]。但自然發(fā)酵的蔬菜，發(fā)酵品質(zhì)不一，發(fā)酵周期較難控制，

雜菌較多，易出現(xiàn)亞硝酸鹽超標現(xiàn)象。因此，發(fā)酵蔬菜的食品安全問題不容忽視。亞硝酸鹽含量是發(fā)酵蔬菜加工貯藏過程中不可忽視的一個重要指標[6-7]。亞硝酸鹽攝入過多會對人體產(chǎn)生多種危害，主要包括形成亞硝胺致癌物質(zhì)以及引發(fā)高鐵紅蛋白癥[8]，威脅人體健康。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將導致內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽歸為2A類致癌物。我國食品中污染物限量規(guī)定蔬菜及其制品中腌漬蔬菜所含亞硝酸鹽的限量不得超過20 mg·kg-1[9]。

乳酸菌是蔬菜發(fā)酵中的主要菌群。發(fā)酵過程中，乳酸菌能迅速增殖產(chǎn)酸，制造厭氧環(huán)境，有效阻止一些有害微生物的活動，且乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、控制人體腸道微生態(tài)平衡、預(yù)防胃腸道疾病、降低血清膽固醇以及增強免疫力等功能。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌還有多種益生菌功能。近年來，許多研究表明，從發(fā)酵蔬菜中篩選出的部分乳酸菌能顯著降低泡菜中亞硝酸鹽的含量[11-12]。張慶芳等[13]對乳酸菌降解亞硝酸鹽機理研究表明，發(fā)酵前期，乳酸菌以亞硝酸鹽還原酶降解為主，產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶將發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽還原。Yang等[14]研究表明，在發(fā)酵至pH低于5時，亞硝酸鹽以酸降解為主，乳酸菌代謝產(chǎn)生大量酸，抑制了雜菌的生長繁殖和硝酸還原酶的活力，H+與亞硝酸鹽發(fā)生非酶歧化反應(yīng)等都促使了亞硝酸鹽含量的降低。因此，篩選高效降解亞硝酸鹽能力的優(yōu)良菌株，運用于現(xiàn)代發(fā)酵蔬菜標準化生產(chǎn)，以提高發(fā)酵蔬菜的產(chǎn)品質(zhì)量與安全性，是發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)措施[15]。本文收集了我國多地的不同種類發(fā)酵蔬菜，旨在從中篩選出具有高效降解亞硝酸鹽能力，并且具有耐酸耐膽鹽以及耐鹽性能與產(chǎn)酸能力優(yōu)良的菌株，為滿足發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)對安全性能高的優(yōu)質(zhì)菌種資源的需求提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

特色發(fā)酵蔬菜來源見表1。

表1 特色發(fā)酵蔬菜來源Table 1 Source of characteristic fermented vegetables

1.1.2 試劑

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、加亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基、加碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基由賽默飛世爾科技公司提供。

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼砂、鹽酸、氯化鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；人工胃液、人工小腸液、林格試劑，上海源葉生物科技有限公司；牛膽鹽，海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-50SII型高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Nikon eclipse 50i電子顯微鏡，上海市衡浩儀器有限公司；Hitachi Regulus 8100冷場發(fā)射掃描電鏡、E-1045鍍金儀，日本日立公司；UV-2600型紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；METTLER TOLEDO精密pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DW-9A型微生物試劑分液器，杭州大微生物有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

分別稱取10 g樣品，加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)后做10倍系列稀釋。取10-6、10-7、10-8各稀釋度0.1 mL液體分別涂布于加碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑選溶鈣圈較大的典型單菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線，獲得純菌株。對菌株進行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶試驗[16]，并將菌株保存于-80 ℃下加有20%甘油的MRS培養(yǎng)基中。

革蘭氏染色鏡檢。制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片，干燥，固定；初染：滴加結(jié)晶紫染色1～2 min，水洗；媒染：用碘液沖去殘水并用碘液覆蓋約1 min，水洗；脫色：吸去殘水，將載玻片傾斜，在白色背景下用流動的95%乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色，立即水洗；復(fù)染：甲基紅染液復(fù)染2 min，水洗，干燥后用油鏡觀察。

過氧化氫酶試驗：取培養(yǎng)18 h的菌株，涂抹于滴有3%過氧化氫的載玻片上，如產(chǎn)生氣泡則為陽性，無氣泡為陰性。

1.2.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

將初步篩選出的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)活化18 h，取菌齡為16 h的培養(yǎng)液，按2%接種量接種于10 mL含NaNO2約250 mg·L-1的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，以含亞硝酸鈉未接種培養(yǎng)基為對照，選取降解亞硝酸鹽能力強的菌株，進行下一步試驗。亞硝酸鹽降解率(%)=(對照組亞硝酸鹽含量-處理組亞硝酸鹽含量)/對照組亞硝酸鹽含量×100。亞硝酸鈉的測量方法用鹽酸萘乙二胺分光光度法[17]。

1.2.3 耐酸耐膽鹽菌株的篩選

試驗方法參照徐晶雪等[18]并做修改。將培養(yǎng)16 h的新鮮菌液混勻，分別取2 mL至2 mL離心管，重復(fù)三管分別標記CT、GJ、BJ，7 500×g4 ℃離心5 min，去上清液，用無菌生理鹽水洗滌兩遍，離心，棄去上清液。模擬胃腸道消化環(huán)境，在洗滌完的離心管中均加入100 μL生理鹽水重懸，在CT中加入900 μL林格試劑，GJ中加入900 μL人工胃液，BJ中加入900 μL人工小腸液，混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h。取出培養(yǎng)液，7 500×g4 ℃離心5 min，棄去上清液，加入2 mL MRS液體培養(yǎng)基，混勻后取20 μL CT、GJ管中的菌液加入到1 mL MRS液體培養(yǎng)基中，取20 μL BJ管中的菌液加入到1 mL添加0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，取200 μL到96孔板中，用酶標儀在波長620 nm處測定24 h各個時段的吸光值，培養(yǎng)溫度為37 ℃，測量間隔0.5 h，繪制生長曲線。

1.2.4 菌株分子生物學鑒定

掃描電鏡：制樣方法參照文獻[19]將篩選出的菌株活化，取2 mL新鮮菌液離心，棄去培養(yǎng)基，用戊二醛固定12 h，用無菌水洗滌，去除戊二醛，然后分別用40%、70%、90%、100%乙醇脫水處理15 min，真空干燥，噴金，用掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察。

DNA的提?。簠⒄瘴墨I[20]進行提取。挑取在MRS固體培養(yǎng)基上純化后的乳酸菌菌落，采用DNA提取試劑盒提取DNA，并對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1495R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴增：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，31個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

分子生物學鑒定采用16S rDNA序列比對的方法[21]。由生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序，與NCBI上標準序列比對，將測定的序列用BLAST( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知細菌的16S rDNA基因片段序列進行比較。從GenBank數(shù)據(jù)庫中，下載已知乳酸菌屬標準菌株的16S rDNA基因序列，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 菌株的耐鹽性及生物學測定

生長曲線：將篩選出的菌株活化，制備菌懸液，按2%接菌量接種到MRS培養(yǎng)基中，混勻，取200 μL到96孔板中，用酶標儀在波長620 nm處測定24 h各個時段的吸光度，培養(yǎng)溫度為37 ℃，測量間隔0.5 h，繪制生長曲線。

耐鹽性[22]：配制含6%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基，將篩選出的菌株活化，制備菌懸液，按2%接菌量依次接種到配制好的高鹽MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，取200 μL到96孔板中，用酶標儀在波長620 nm處測定24 h各個時段的吸光度，培養(yǎng)溫度為37 ℃，測量間隔0.5 h，繪制生長曲線。

產(chǎn)酸能力以及降解亞硝酸鹽能力：將篩選出的菌株活化，制備菌懸液，按2%接菌量依次接種到配制好的含250 mg·L-1MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，分別在0、5、10、15、20、25、30 h測定pH以及亞硝酸鈉含量。

1.2.6 高效降解亞硝酸鹽菌株在泡菜中的應(yīng)用

菌株在發(fā)酵蔬菜中的應(yīng)用參照杜曉華等[23]的方法略作改動。將篩選得到的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，按體積質(zhì)量比1%的接種量接種發(fā)酵制作泡菜。每12 h取樣測定泡菜的pH、亞硝酸鹽含量，直到發(fā)酵成熟，與自然發(fā)酵泡菜進行比較，研究菌株在發(fā)酵泡菜過程中降解亞硝酸鹽的能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解亞硝酸鹽菌株的篩選結(jié)果

從培養(yǎng)皿中挑取溶鈣圈較大的菌株，劃線純化得到純菌株，從中挑選出革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的菌株72株。李梓銘[24]研究顯示，可將具有明顯溶鈣圈、革蘭氏染色為陽性、接觸酶反應(yīng)為陰性的乳白色或白黃色且表面圓滑的菌落初步確定為乳酸菌。因此，初步可判定這72株菌為乳酸菌并作為進一步研究對象。將72株菌進行降解亞硝酸鈉實驗，由表2可知，72株菌株對亞硝酸鈉的降解能力在4.931%～99.347%，其中30株菌株的亞硝酸鈉降解率達85%以上。這與肖秋穎等[25]研究結(jié)果相似，其研究結(jié)果顯示，亞硝酸鈉降解率在80%以上的菌株占50%以上，表明大部分乳酸菌都有一定的亞硝酸鈉降解能力。

續(xù)表2 Continued Table 2

2.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽結(jié)果

乳酸菌對外界環(huán)境較為敏感，作為益生菌進入人體腸道內(nèi)，各種消化液、酶也會對其生存與繁殖產(chǎn)生影響，因此對篩選得到的具有較強亞硝酸鈉降解能力的菌株進行耐酸耐膽鹽試驗，得到結(jié)果如表3。結(jié)果顯示：在常規(guī)生長環(huán)境中，21株乳酸菌生長良好；經(jīng)人工胃液處理的18株乳酸菌生長良好，表現(xiàn)出了耐酸性；30株乳酸菌耐膽鹽性普遍一般，其中有8株有相對較好的耐膽鹽能力。綜合降亞硝酸鹽、耐酸、耐膽鹽的結(jié)果，JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6五株乳酸菌兼具良好的耐酸耐膽鹽能力，能適應(yīng)消化道環(huán)境，可作為發(fā)酵菌株應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜。

表3 耐酸耐膽鹽測定結(jié)果Table 3 Test results of acid and bile salt resistance

續(xù)表3 Continued Table 3

2.3 高效降解亞硝酸鹽菌株的形態(tài)學鑒定以及分子生物學鑒定結(jié)果

2.3.1 菌落形態(tài)以及掃描電鏡結(jié)果

將上述篩選的具有較強降解亞硝酸鈉能力以及耐酸耐膽鹽能力的5株菌株進行形態(tài)學分析。5株菌的菌落形態(tài)如圖1所示。由圖1可以看出，菌株JLSC1-1和JLSC2-6的菌落形態(tài)相似，在MRS固體平板上直徑為1.0～1.5 mm，白色，略透明，圓形，邊緣整齊表面光滑，稍隆起。菌株HNLJJ-2在MRS固體平板上直徑為1.0 mm，乳白色，不透明，圓形，邊緣整齊表面光滑，隆起。菌株CXG-1的菌落形態(tài)與CXG-6相似，在MRS固體平板上直徑為1.0～1.5 mm，乳白色，不透明，圓形，邊緣整齊表面光滑，隆起。對5株菌進行電鏡掃描，結(jié)果如圖2。圖2顯示，菌株JLSC1-1、JLSC2-6、CXG-1和CXG-6形態(tài)相似，均為短桿狀，JLSC1-1和JLSC2-6菌表面光滑，且JLSC2-6菌體稍長；CXG-1和CXG-6表面粗糙，且CXG-1稍長。菌株HNLJJ-2為短桿狀，比前兩株長且表面光滑。

2.3.2 菌株16S rDNA基因序列分析

將菌株JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6的16S rDNA序列結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，選取部分同源性較高的不同菌株，用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

經(jīng)鑒定，5株菌均為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。JLSC1-1與Lactobacillusplantarumstrain 2945、Lactobacillusplantarumstrain CAU：225、Lactobacillusplantarumstrain 5137有100%的同源性。JLSC2-6與Lactobacillusplantarumstrain 3335、Lactobacillusplantarumstrain 3742有100%的同源性。HNLJJ-2與Lactobacillusplantarumstrain 7071有100%的同源性。CXG-1與Lactobacillusplantarumstrain 1888、Lactobacillusplantarumstrain 6541有99.86%的同源性。CXG-6與Lactobacillusplantarumstrain Heal19、LactobacillusplantarumSN13T有100%的同源性。結(jié)合菌落形態(tài)、菌株形態(tài)以及16S rDNA鑒定結(jié)果，將JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6均鑒定為植物乳桿菌。

2.4 乳酸菌生長性能

2.4.1 乳酸菌生長曲線

由圖4可知，5株菌均有良好的長勢，在培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)12 h后進入穩(wěn)定期。菌株HNLJJ-2與CXG-1在對數(shù)生長期生長較快。在穩(wěn)定生長期，JLSC2-6、HNLJJ-2與CXG-1長勢相似，且均比JLSC1-1與CXG-6具有更高的D值。

此生長趨勢與大部分植物乳桿菌的生長趨勢相同。

2.4.2 乳酸菌產(chǎn)酸性能

5株菌發(fā)酵時培養(yǎng)基的pH變化如圖5所示。5株菌發(fā)酵時pH持續(xù)降低，15 h后逐漸穩(wěn)定在3.7左右，且它們的pH變化趨勢基本一致，表明5株菌均有良好的產(chǎn)酸能力。

2.4.3 乳酸菌耐鹽實驗結(jié)果

大部分發(fā)酵蔬菜中，鹽含量往往較高。高濃度的鹽溶液能有效抑制一些有害微生物的生長，但鹽濃度過高對發(fā)酵乳酸菌也會產(chǎn)生抑制作用[26]。對篩選出的5株菌在高鹽濃度(鹽含量為6%)下進行耐鹽試驗，這5株菌的生長結(jié)果見圖6。

相對初始的D值，5株菌的D值均有不同程度的上升，但生長狀況均有所抑制。0～12 h時，HNLJJ-2生長最快，其次是JLSC2-6，JLSC1-1生長最慢。12～24 h時，JLSC2-6一直保持著較其他4株菌長勢好，而JLSC1-1長勢較慢。表明5株菌中，JLSC2-6的耐鹽性比其他菌株更強。

2.4.4 乳酸菌的亞硝酸鈉降解曲線

5株菌的亞硝酸鈉降解曲線如圖7所示，對亞硝酸鈉的降解率均在15 h后趨于穩(wěn)定，在20 h后均能達到98%以上。而在發(fā)酵的前15 h，JLSC2-6的亞硝酸鈉降解率始終高于其他菌株，在發(fā)酵10 h時，其降解率已達到87.52%。發(fā)酵30 h后，其降解率高達99.06%。結(jié)果表明，菌株JLSC2-6相比于其他4株菌具有更優(yōu)良的降解亞硝酸鈉能力，能更快速降解發(fā)酵蔬菜中產(chǎn)生的亞硝酸鹽。

2.5 高效降解亞硝酸鹽菌株在泡菜中的應(yīng)用

選用耐酸、耐膽鹽、耐鹽以及降解亞硝酸鹽能力強的菌株JLSC2-6進行應(yīng)用試驗，將JLSC2-6活化后按1%接種量接種制作泡菜，以自然發(fā)酵泡菜做對照，分別添加30 mg·kg-1NaNO2，考察JLSC2-6在泡菜發(fā)酵過程中對亞硝酸鈉的降解作用。發(fā)酵過程中pH與亞硝酸鈉含量變化如圖8和圖9所示。

由圖8可知，接種菌株JLSC2-6發(fā)酵的泡菜產(chǎn)酸速度顯著高于自然發(fā)酵的泡菜，發(fā)酵12 h時pH為3.54，而后pH一直處于3.5以下且呈穩(wěn)定狀態(tài)。自然發(fā)酵的泡菜發(fā)酵48 h后pH降至3.9，發(fā)酵72 h后pH才降至3.5以下。自然發(fā)酵前期，雜菌較多，乳酸菌處于繁殖階段，酸性環(huán)境尚未形成，后期隨著發(fā)酵的進行乳酸菌大量繁殖，pH下降。而接種發(fā)酵前期接入大量的乳酸菌，產(chǎn)生了大量的酸，快速降低了pH，抑制了雜菌的繁殖。

泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鈉含量變化見圖9，發(fā)酵12 h時，接種發(fā)酵的泡菜中亞硝酸鈉含量顯著下降，降至2.69 mg·kg-1，且持續(xù)下降，36 h回升至2.37 mg·kg-1，而后持續(xù)下降，84 h后降至1 mg·kg-1以下。而自然發(fā)酵的泡菜中亞硝酸鈉含量降至20.86 mg·kg-1后又急劇升高，到36 h時出現(xiàn)亞硝峰，此時泡菜中亞硝酸鈉含量高達87.37 mg·kg-1，而pH為4.23，直至60 h后亞硝酸鈉含量才降解至20 mg·kg-1以下。此結(jié)果與黃麗慧等[27]的研究結(jié)果一致，大量研究表明，自然發(fā)酵的蔬菜腌漬過程中亞硝酸鹽含量均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，且在pH為4左右時出現(xiàn)亞硝峰現(xiàn)象，而后亞硝酸鹽含量下降。試驗表明菌株JLSC2-6在泡菜發(fā)酵過程中能高效降解泡菜發(fā)酵過程中原有的以及產(chǎn)生的亞硝酸鹽。此結(jié)果與杜曉華等[23]的研究結(jié)果相似，以植物乳桿菌N2按10%的接種量接種發(fā)酵制作泡菜，有效降解了發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽。

3 結(jié)論

本研究從農(nóng)家自制、腌制蔬菜工廠以及實驗室自制的醬腌野生菌、臭菜梗、酸菜、辣椒醬、雪菜以及泡菜中分離出72株菌，初步判斷為乳酸菌。從中篩選出30株具有良好降解亞硝酸鈉能力的菌株，通過耐酸耐膽鹽實驗，得到5株能適應(yīng)消化道環(huán)境具有益生菌性能的菌株JLSC1-1、JLSC2-6、HNLJJ-2、CXG-1、CXG-6，綜合形態(tài)學鑒定以及分子生物學鑒定結(jié)果，確定5株菌均為植物乳桿菌。對其進行性能初步探究發(fā)現(xiàn)，JLSC2-6具有優(yōu)良的生長繁殖能力，產(chǎn)酸性能和耐鹽性以及高效降解亞硝酸鹽能力。將其應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜的制作，能有效降低發(fā)酵過程中產(chǎn)生的亞硝酸鈉，其降解機理以及其他方面的益生菌功能等還有待進一步研究。