豬長鏈非編碼RNA lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

吳俊靜，喬 木，周佳偉，梅書棋，彭先文

(動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種危害極大的傳染性免疫抑制性疾病。PRRSV具有嚴(yán)格的宿主和細(xì)胞嗜性，入侵宿主細(xì)胞依賴細(xì)胞特異性受體，如CD163[1]。PRRSV只感染豬，不感染其他物種，且主要感染單核巨噬細(xì)胞系中分化完全的細(xì)胞，尤其是豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAM)。在體外，PRRSV可在PAM、PK-CD163、Marc-145等細(xì)胞中增殖[2]。由于PRRSV具有變異快且復(fù)雜、免疫抑制、存在抗體依賴性增強(qiáng)作用等特征，目前疫苗控制效果并不理想。雖然，近年來國內(nèi)外學(xué)者通過敲除CD163基因關(guān)鍵序列成功獲得了抗PRRS的基因編輯豬[3-4]，但是其產(chǎn)業(yè)化的道路還不明朗。因此，亟待尋找防治PRRS新藥設(shè)計(jì)的靶分子、研發(fā)有效的新型防治技術(shù)、培育抗病新品種。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸、缺少特異完整的開放閱讀框、沒有或很少有蛋白編碼功能的RNA分子，這類RNA廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳學(xué)調(diào)控，包括調(diào)控甲基化、染色質(zhì)重塑、基因印記和計(jì)量補(bǔ)償?shù)裙δ躘5]。由于lncRNA的表達(dá)譜具有較強(qiáng)的細(xì)胞類型特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性等，因此可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，更容易被利用開發(fā)為精準(zhǔn)藥物。已有研究表明，lncRNA在免疫和宿主對(duì)病毒感染的應(yīng)答中發(fā)揮作用[6]。病原可能利用lncRNA能控制基因轉(zhuǎn)錄過程的特性而劫持宿主細(xì)胞[7]。然而，相對(duì)于mRNA和miRNA而言，有關(guān)lncRNA在PRRSV感染過程中的作用及機(jī)制的研究報(bào)道較少。

前期研究利用高通量測序技術(shù)分析了PAMs在感染PRRSV前后全轉(zhuǎn)錄組變化差異[8]，發(fā)現(xiàn)一種豬新lncRNA，命名為豬lnc-000649，其在PRRSV感染后顯著下調(diào)表達(dá)。本研究通過構(gòu)建豬lnc-000649的超表達(dá)載體，在細(xì)胞水平進(jìn)一步分析了該lncRNA在PRRSV感染增殖中的作用，以期望獲得防治PRRS藥物研發(fā)的新設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)

PAM細(xì)胞的原代培養(yǎng)，采用4～5周齡左右的健康大白豬(PRRSV等各病原檢測陰性)，在干凈無菌的環(huán)境中取全肺，用PBS緩沖液(加1%青霉素和鏈霉素)分批次緩慢灌入肺中(大約400～500 mL)，每次對(duì)灌滿的肺進(jìn)行肺部按摩，并用吸管輕輕吹打，使其細(xì)胞團(tuán)及黏液塊打散，用無菌紗布過濾收集灌洗液，1 600 ×g離心10 min收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液(加1%青霉素和鏈霉素)進(jìn)行洗滌，1 600 ×g離心10 min；重復(fù)洗滌1～2次。將洗滌好的細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后，于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)2 h。除去未貼壁的細(xì)胞，余下細(xì)胞即可消化傳入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分離的細(xì)胞用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，分裝凍存。

Marc-145細(xì)胞系來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖含量不低于4 500 mg·L-1)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 PAM細(xì)胞總RNA抽提

利用TRIzol、氯仿法提取PAM細(xì)胞總RNA。使用NanoDrop 1000微量分光光度計(jì)檢測RNA樣品濃度與D值，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3 豬lnc-000649全長序列片段擴(kuò)增及鑒定

取1 μg的總RNA樣本，利用Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。用無RNAase去離子水將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋5倍后作為PCR反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增獲得豬lnc-000649全長序列片段。PCR引物對(duì)：5′-GGCGAGGAAGTGCTGATG-3′和5′-TATGATGGTTCCCAGGCT-3′。PCR退火溫度為55 ℃，延伸時(shí)間為90 s。PCR產(chǎn)物送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。

1.4 豬lnc-00649超表達(dá)載體構(gòu)建

以PAM細(xì)胞的cDNA為模板，利用引物對(duì)5′-CAAGCTTGGCGAGGAAGTGCTGATG -3′和5′-CTCTAGATATGATGGTTCCCAGGCT-3′，PCR擴(kuò)增獲得包含HindⅢ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的豬lnc-000649全長序列片段。然后，利用內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物和骨架載體pcDNA3.1(+)載體(購自Invitrogen公司)分別進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為50 μL，于37 ℃酶切2 h。隨后對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，利用T4 DNA Ligase于16 ℃過夜連接。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司對(duì)插入序列進(jìn)行測序。測序正確的陽性克隆用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取抽提試劑盒(Omega E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini KitⅠSpin)抽提重組載體DNA并測定濃度，命名為lnc-000649-pcDNA3.1。同時(shí)，用HindⅢ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切該載體，再次驗(yàn)證插入片段正確性。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與PRRSV感染

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)，利用Thermo公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000分別將構(gòu)建的豬lnc-000649超表達(dá)載體lnc-000649-pcDNA3.1和空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)入PAM或Marc-145細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為3組：A，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)(空載體組)；B，轉(zhuǎn)染lnc-000649-pcDNA3.1載體；C，不轉(zhuǎn)染任何載體(空白對(duì)照組)；重復(fù)3次。

各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，用0.5 MOI劑量的PRRSV-WUH3毒株感染細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液換為含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(PAM細(xì)胞)或DMEM培養(yǎng)基(Marc-145細(xì)胞)。PAM細(xì)胞感染后24 h收集細(xì)胞，利用Trizol消化細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后用于PRRSV RNA的熒光定量PCR檢測。Marc-145細(xì)胞感染36 h后，反復(fù)凍融3次收集毒液，用于病毒滴度的檢測。

1.6 豬lnc-000649與PRRSV RNA的熒光定量PCR檢測

以PAM細(xì)胞的cDNA為模板，利用表1引物序列、TaKaRa公司THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒，配制熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)：qPCR mix 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水8 μL。利用Roche公司LightCycler480熒光定量PCR儀，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。以β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。

表1 熒光定量PCR引物信息表Table 1 Information of the qPCR primers

1.7 PRRSV病毒滴度檢測

將病毒原液使用DMEM培養(yǎng)基倍比稀釋8個(gè)梯度后，加入預(yù)先鋪有Marc-145細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)梯度做8個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立不接毒的對(duì)照組，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育96 h，觀察細(xì)胞病變孔數(shù)，用Karber法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬lnc-000649在PAM細(xì)胞中表達(dá)情況

在PAM細(xì)胞中，利用熒光定量PCR的方法檢測了豬lnc-000649在PRRSV感染前后的PAM細(xì)胞中的表達(dá)水平，證實(shí)豬lnc-000649在PAM細(xì)胞中表達(dá)，且在PRRSV感染組中表達(dá)顯著下調(diào)(圖1)。

2.2 豬lnc-000649超表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)全轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲得的豬lnc-000649序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得1 483 bp條帶(圖2)，并將PCR產(chǎn)物回收測序后發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的豬lnc-000649序列完全一致。再次證明豬lnc-000649在PAM細(xì)胞中確實(shí)存在。為了進(jìn)一步研究豬lnc-000649的功能，我們將豬lnc-000649全長序列插入pcDNA3.1(+)載體中，成功構(gòu)建了豬lnc-000649超表達(dá)載體lnc-000649-pcDNA3.1。經(jīng)Sanger測序以及HindⅢ和XbaⅠ雙酶鑒定(圖3)結(jié)果顯示，插入片段正確。

2.3 豬lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

在PAM細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建的豬lnc-000649超表達(dá)載體lnc-000649-pcDNA3.1，以分析豬lnc-000649對(duì)PRRSV在細(xì)胞感染增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的PAM細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染lnc-000649-pcDNA3.1載體的PAM細(xì)胞中豬lnc-000649表達(dá)水平上調(diào)了5 214倍(圖4)，說明成功構(gòu)建了豬lnc-000649超表達(dá)細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上，PRRSV分別感染了豬lnc-000649超表達(dá)PAM細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了PRRSV感染24 h后細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的含量，結(jié)果表明，在超表達(dá)豬lnc-000649的PAM細(xì)胞中PRRSV RNA水平極顯著(P<0.01)低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組及未處理組細(xì)胞(圖5)。同時(shí)，在Marc-145細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)超表達(dá)lnc-000649組的PRRSV病毒滴度(TCID50)顯著(P<0.01)低于對(duì)照組細(xì)胞(圖6)。以上結(jié)果表明，超表達(dá)豬lnc-000649對(duì)PRRSV增殖具有抑制作用。

3 討論

lncRNA廣泛存在于動(dòng)植物中，物種之間保守性低，它們曾長期被誤認(rèn)為是遺傳“暗物質(zhì)”，但近些年研究證實(shí)這類RNA是廣泛存在于細(xì)胞活動(dòng)中的一類新型調(diào)節(jié)因子。目前已發(fā)現(xiàn)lncRNA具有多種功能，可以調(diào)控甲基化[9]、染色質(zhì)重塑[10]、選擇性剪接[5]、印跡和劑量補(bǔ)償[11]。這些能調(diào)控基因表達(dá)的作用，使其在各種生物過程中發(fā)揮廣泛作用。例如，lncRNAHOTAIR參與新陳代謝調(diào)控[12]；lncRNAXIST參與X-染色體印記調(diào)控[13]；lncRNAAirn參與發(fā)育調(diào)控[14]；lncRNAHOTTIP與干細(xì)胞多能性相關(guān)[15]。lncRNA作用機(jī)制復(fù)雜多樣，有的lncRNA是作為信號(hào)分子，可在空間和時(shí)間上調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)基因；有的lncRNA作為誘餌分子，與染色質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白質(zhì)結(jié)合，或作為miRNA靶點(diǎn)的誘餌；有的lncRNA作為引導(dǎo)分子，招募染色質(zhì)修飾酶靶向目標(biāo)基因，或以順式或反式作用靶向某一特定基因；還有的lncRNA作為支架分子，將多種蛋白質(zhì)聚集在一起形成核糖核蛋白復(fù)合物發(fā)揮特定生物活性功能[16]。然而，大多數(shù)lncRNA調(diào)控基因表達(dá)的方式及具體作用機(jī)制尚不清楚，還有更多的具有功能lncRNA有待發(fā)掘。

較多研究表明，lncRNA在免疫和宿主對(duì)病毒感染的應(yīng)答中發(fā)揮作用[6-7]。Ouyang等[17]報(bào)道，位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的lncRNA可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或抗病毒基因(如干擾素刺激基因)的轉(zhuǎn)錄；lncRNANEAT1能介導(dǎo)未剪接人類免疫缺陷病毒(HIV)轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制HIV的復(fù)制[18]；lncRNANRAV可抑制干擾素刺激基因的表達(dá)而影響流感病毒的復(fù)制以及宿主免疫[19]；lncRNALethe既可以負(fù)調(diào)控NF-κB調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，又能抑制Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，進(jìn)一步促進(jìn)丙肝病毒的復(fù)制[20-21]。lncRNA是否也參與PRRSV感染后的免疫應(yīng)答過程，國內(nèi)外這方面研究相對(duì)較少。陳曦[22]發(fā)現(xiàn)，lncRNAALDB4471參與宿主對(duì)PRRSV的免疫應(yīng)答；甘利鵬等[23]發(fā)現(xiàn)，lncRNATCONS_00179042顯著抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中感染增殖，且PRRSV感染后導(dǎo)致該lncRNA下調(diào)表達(dá)，從而有利于病毒自身的復(fù)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，PAM細(xì)胞中存在一種新的長鏈非編碼RNA，命名為lnc-000649，在PRRSV感染后下調(diào)表達(dá)，且在PAM細(xì)胞中超表達(dá)豬lnc-000649后可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)PRRSV RNA的含量。同時(shí)，在Marc-145細(xì)胞中超表達(dá)豬lnc-000649后也可以顯著抑制病毒增殖，說明豬lnc-000649具有抑制PRRSV感染增殖的效果。為了進(jìn)一步分析豬lnc-000649影響PRRSV感染增殖的潛在機(jī)制，預(yù)測了其可能的共定位和共表達(dá)靶基因情況。豬lnc-000649的共定位基因僅發(fā)現(xiàn)ARNT2基因，位于其下游94 314 bp處。然而，ARNT2基因主要報(bào)道與下丘腦-垂體軸發(fā)育、出生后腦生長、視覺和腎功能發(fā)育，以及癌癥發(fā)生相關(guān)[24]。根據(jù)全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，預(yù)測獲得了195個(gè)豬lnc-000649的共表達(dá)基因(皮爾森相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.95)，其中包括IRF7、ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT3、IFIT5、RSAD2、MX1、GBP1等與免疫或PRRSV感染相關(guān)基因。研究哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)，在病毒入侵時(shí)會(huì)激活干擾素天然免疫信號(hào)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，其通過激活數(shù)百個(gè)干擾素刺激基因發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)效應(yīng)[25]。IRF7編碼干擾素調(diào)節(jié)因子7，在病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用[26]；ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT3和IFIT5是干擾素誘導(dǎo)蛋白，均具有抗病毒效應(yīng)[25，27]。研究表明，PRRSV可通過干擾IRF7活性來抵消Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的早期抗病毒狀態(tài)[26]；ISG20超表達(dá)能顯著抑制PRRSV增殖[28]；RSAD2可以通過阻斷早期病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄來抑制病毒增殖[29]。同時(shí)，MX1與GBP1也是重要的抗病毒分子[27]，且與豬對(duì)PRRSV病毒的抵抗和T細(xì)胞的有效激活顯著相關(guān)[30]。因此，豬lnc-000649可能通過這些潛在的靶基因來影響PRRSV增殖。另一方面，根據(jù)所獲得的豬lnc-000649序列，利用miRDate (v3.3a)預(yù)測了其可能存在靶向作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)豬lnc-000649序列上存在miR-125、miR-30、miR-23、miR-29、miR-10等miRNA的作用靶點(diǎn)。而以上這些miRNA均報(bào)道參與調(diào)控PRRSV感染增殖過程[31-34]。lnc-000649也有可能與這些miRNA的靶基因競爭性結(jié)合，從而參與調(diào)控PRRSV感染增殖。然而lnc-000649具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。