富硒酵母干預(yù)對高脂小鼠GRP78基因表達的影響

吳谷豐　龔順民　劉麗君　王凱旋　李青連　郝澍

摘 要：目的：探討富硒酵母干預(yù)對高脂大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因GRP78表達的影響。方法：選取40只6周齡小鼠作為研究對象，建立高脂小鼠模型，并隨機分為4組（a：對照組，b：高脂日糧組，c：高脂日糧+低劑量富硒酵母組，d：高脂日糧+高劑量富硒酵母組），觀察肝臟脂肪變性程度，檢測肝臟脂質(zhì)氧化MDA水平和GRP78基因的mRNA表達水平。結(jié)果：高脂日糧可以誘發(fā)小鼠肝臟指數(shù)增大和脂肪變性，飼喂富硒酵母后，小鼠的肥胖和肝臟脂肪變性得到了明顯改善;高脂日糧組與其他組相比肝臟中MDA和GRP78基因的表達水平顯著升高，高劑量硒酵母對高脂誘發(fā)的MDA升高和GRP78基因的表達水平均有拮抗作用。結(jié)論：硒能逆轉(zhuǎn)高脂小鼠的肝臟損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在其中發(fā)揮了作用，該應(yīng)激可能是通過提高氧化水平而誘導(dǎo)的。

關(guān)鍵詞：高脂;富硒酵母;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;GRP78基因

中圖分類號 R332文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）03-0012-04

Effect of Selenium Enriched Yeast Intervention on GRP78 Gene Expression in High-fat Mice

WU Gufeng1 et al.

（1School of Pharmacy and Life Science，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China）

Abstract： Objective：To investigate the effect of selenium enriched yeast intervention on the endoplasmic reticulum stress gene GRP78 expression in high-fat rats. Methods：A total of 40 mice were selected as the research object to establish high-fat mouse model， and randomly divided into 4 groups （a： control group， b： high-fat diet group， c： high-fat diet + low dose of selenium enriched yeast group， d： high-fat diet + high dose group of selenium enriched yeast）. Then， the degrees of liver steatosis were observed， and the liver MDA level and lipid oxidation of GRP78 gene mRNA expression level were detected. Results：High-fat diet could induce the increase of liver index and alleviate steatosis in mice. Compared with other groups， the expression levels of MDA and GRP78 genes in liver were significantly increased， and the high-dose selenium enriched yeast had an inhibitive effect on increase of MDA and the expression levels of GRP78 genes. Conclusion：Selenium can reverse liver injury in high-fat mice， and endoplasmic reticulum stress signaling pathway plays a role in it， which may be induced by increased oxidation levels.

Key words： High-fat; Selenium enriched yeast; Endoplasmic reticulum stress; GRP78 gene

近些年來，隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并已成為嚴(yán)重威脅著我國居民健康的重大疾病[1]。目前，誘發(fā)心血管疾病的病因較多且較復(fù)雜，其中高脂飲食引發(fā)的血脂異常是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素之一[2，3]。據(jù)國家心血管病中心統(tǒng)計顯示，截至2018年，我國血脂異常人數(shù)已超過4億人。研究表明，高脂飲食可誘導(dǎo)組織與細胞內(nèi)產(chǎn)生并累積大量的自由基，從而引起氧化應(yīng)激，對組織和細胞造成損傷，除此之外還能引起炎性反應(yīng)和胰島素抵抗[4，5]。脂肪組織分泌的促炎性細胞因子能夠激活下丘腦垂體腎上腺軸，使得系統(tǒng)和代謝之間形成惡性循環(huán)。

GRP78（Glucose regulated protein，GRP78）是一種分子質(zhì)量為78ka的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的核心調(diào)節(jié)因子，傳統(tǒng)認(rèn)為其主要功能為結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+、維持細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定性。近年來，更多的研究發(fā)現(xiàn)GRP78在腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用，與腫瘤細胞的存活、增殖、腫瘤治療的敏感性密切相關(guān)[6]。

硒是一種人與動物所必需的微量礦物質(zhì)元素，并通過硒代半胱氨酸合成含硒蛋白而發(fā)揮其生理功能。目前，國內(nèi)外研究重點主要放在營養(yǎng)水平或一定范圍內(nèi)高于營養(yǎng)水平的硒尤其是有機硒具有調(diào)節(jié)機體膽固醇等生化指標(biāo)的改善，而硒能否調(diào)控高脂血癥帶來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究則較少。江西省作為富硒地區(qū)，富硒產(chǎn)品的研發(fā)具有十分廣闊的前景。富硒酵母是一種高效、安全的硒補充劑。為此，本研究探討了富硒酵母對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖的逆轉(zhuǎn)作用，并初步通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子的表達揭示其在抗高脂血癥中發(fā)揮的作用，以期為江西省富硒產(chǎn)品的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 高脂日糧配方：基礎(chǔ)日糧中添加20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇和0.2%膽酸鈉。富硒酵母（硒含量2000ppm）購于安琪酵母有限公司（生產(chǎn)批號：20141021-02），相應(yīng)檢測試劑盒購于碧云天生物公司?？鼓齽╄蹤此徕c購于自索萊寶公司。RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR定量分析相關(guān)試劑SYBR Green購于Takara公司。

1.2 試驗設(shè)計 清潔級小鼠（18.5±0.54g，6周齡，雌雄各半），購于南昌大學(xué)實驗動物中心。小鼠適應(yīng)7d后隨機分成4組，每組10只。整個試驗期間小鼠自由飲水和攝取日糧，每7d稱重1次，具體分組如下：a：對照組（飼喂常規(guī)日糧）;b：高脂日糧組（飼喂高脂日糧）;c：高脂日糧+低劑量富硒酵母組（按照小鼠體重2μg/kg劑量經(jīng)口灌胃富硒酵母）;d：高脂日糧+高劑量富硒酵母組（按照小鼠體重8μg/kg劑量經(jīng)口灌胃富硒酵母）。

1.3 樣品處理及測定項目 第7周結(jié)束，眼球采血，3000r離心后獲得血清。頸椎脫臼處死小鼠，解剖收集肝臟后稱重。一部分浸泡于福爾馬林溶液中用于做病理切片，另一部分用PBS沖洗干凈后保存于?70℃冰箱中。

1.3.1 病理切片（HE染色） 取部分肝組織，經(jīng)水洗、脫水透明、浸蠟、包埋，得到肝組織石蠟切片，采用顯微鏡觀察不同處理條件下組織細胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.3.2 抗氧化水平測定 MDA檢測按照測定試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定肝臟中MDA的含量。

1.3.3 相對熒光定量PCR 肝組織中的GRP78的mRNA水平用相對熒光定量PCR進行測定。用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑盒，根據(jù)說明書從冰凍的組織中提取總RNA。根據(jù)Oligo dT primers和RNase M-MLV（TaKaRa，China）說明書取1μg總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。小鼠GRP78的引物序列如表1所示。用Prism Step-One Plus系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系見表1。以GAPDH為內(nèi)參用2?ΔΔCt法計算mRNA相對水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對小鼠肝臟脂肪的影響 由圖1A可知，從第4周起，高脂日糧組的小鼠體重開始顯著高于對照組（P<0.05）。圖1B是各組小鼠的肝臟指數(shù)。經(jīng)過42d的高脂飼料誘導(dǎo)，與對照組相比，高脂組的肝臟指數(shù)極顯著升高（P<0.01），灌胃低劑量硒酵母干預(yù)后，肝臟指數(shù)顯著下降（P<0.05），灌胃高劑量富硒酵母后，肝臟指數(shù)極顯著下降（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由圖1C可知，40倍鏡下觀察，HE染色后的高脂飼料組對比對照組，存在明顯的脂肪變性;而加入富硒酵母干預(yù)后，脂肪變性得到明顯改善。由圖1D可知，肉眼所見下，高脂飼料組的小鼠肝臟明顯變大變黃，呈現(xiàn)出脂肪肝的特性。

2.2 富硒酵母對高脂飲食小鼠肝臟組織中氧化水平的影響 如圖2可知，高脂日糧組與其他組相比肝臟中MDA極顯著升高（P<0.01），高劑量硒酵母對高脂誘發(fā)的MDA升高有拮抗作用（P<0.05）。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達變化 由圖3可知，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78的表達，對照組與高脂日糧組、高脂日糧+低劑量富硒酵母組、存在顯著差異（P<0.05）;且加富硒酵母干預(yù)后，低劑量和高劑量均可以降低GRP78的表達（P<0.05）。

3 討論

硒是一種人類與動物所必需的微量元素，含硒蛋白在脂蛋白和膽固醇代謝中具有重要的作用[7，8]。Larvie等研究表明，缺硒與肥胖癥呈顯著正相關(guān)，超重/肥胖個體中硒蛋白SEPP1濃度和GPX活性顯著低于正常體重個體[9]。流行病學(xué)研究表明，高劑量的血清硒濃度可以提升血脂水平的效果。對1042名英國成人進行橫斷面分析發(fā)現(xiàn)，血漿硒水平的升高常伴有TC和LDL的下降[10]。因此，適量地補硒可以相對有效地降低機體的血脂水平。

硒是一種非可再生資源，主要來源于富硒土壤中種植的植物。然而，中國絕大多數(shù)地區(qū)屬于缺硒或者貧硒土壤，且食物中50%～75%的硒含量會在日常的烹飪中損耗，因此，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對食品中的硒進行生物強化就顯得尤為重要[11]。先前硒通常是通過亞硒酸鈉添加到食物中，進一步研究證實，有機硒的吸收利用率高于無機硒且毒副作用更低，更適合作為膳食補充劑。酵母菌可快速增長，便于培養(yǎng)，且有積累硒的高容量，因此，酵母菌成為添加有機硒的最普遍使用的且研究最早的載體[12，13]，其主要產(chǎn)物是硒蛋氨酸。

遺傳或環(huán)境損傷引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與眾多人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有一個標(biāo)志性因子：GRP78，該因子可以啟動未折疊蛋白反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定、對抗細胞凋亡并促進腫瘤的內(nèi)藥性等[15]。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致脂肪組織功能紊亂的重要原因之一[16.17]，因此，探討調(diào)節(jié)脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的有效措施對于改善脂肪組織功能紊亂具有重要的意義。

飼喂高脂日糧是建立小鼠高脂血癥模型的經(jīng)典方法，主要由于攝入過多脂肪從而導(dǎo)致能量攝取過量，最終引起體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。本研究結(jié)果顯示，同時飼喂富硒酵母后，小鼠的肥胖和肝臟脂肪變性得到了明顯改善，且與硒濃度的提高成正相關(guān)，提示有機硒是一種安全的逆轉(zhuǎn)高脂的添加劑。灌胃硒酵母干預(yù)后，肝臟組織中MDA含量下降，證明硒酵母對機體具有良好的抗氧化調(diào)節(jié)作用。利用熒光定量PCR法來測定組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78的mRNA相對水平，證明高脂可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，該應(yīng)激可能是通過提高氧化水平而誘導(dǎo)的。

綜上所述，硒能逆轉(zhuǎn)高脂小鼠的肝臟損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在其中發(fā)揮了作用。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項目：江西省科技廳，青年科學(xué)基金資助項目，20202BABL216042;江西省教育廳，科技項目，GJJ161081;九江學(xué)院，教學(xué)改革研究課題，XJJGYB-19-13;江西省衛(wèi)生廳，江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題，2017B072。

作者簡介：吳谷豐（1999—），男，本科生。 *通訊作者? 收稿日期：2020-12-18