穴位埋線對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知行為、海馬神經(jīng)元丟失程度及BDNF蛋白表達(dá)的影響*

劉 征,馬 琳,畢海洋，王瑞瑩,胡其回,戚素梅,劉紅玉,梁芳妮,于楠楠△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇是一種腦部神經(jīng)元過度同步化放電所致的發(fā)作性腦病。作為神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病，癲癇反復(fù)發(fā)作會(huì)引起神經(jīng)元損傷，使其產(chǎn)生不可逆的凋亡或死亡。而海馬神經(jīng)細(xì)胞的脫失又可造成癲癇患者認(rèn)知功能障礙，且可能與慢性癲癇發(fā)作易感性關(guān)系密切，因此探索多種方式對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，或可起到減少癲癇發(fā)作及緩解癲癇發(fā)作程度、改善認(rèn)知功能的作用[1]。已有臨床研究證實(shí)，穴位埋線治療癲癇可以減少患者復(fù)發(fā)率，改善發(fā)作時(shí)的意識(shí)狀態(tài)，減少抽搐持續(xù)時(shí)間并提高患者生活質(zhì)量[2]。筆者通過建立氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型，觀察穴位埋線對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知行為學(xué)、海馬神經(jīng)元丟失程度及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白表達(dá)的影響，以期為穴位埋線治療癲癇伴認(rèn)知障礙提供更詳實(shí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組情況

隨機(jī)將體質(zhì)量180～200 g的80只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠[許可證號(hào)：SCXK(黑)2013004，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供]分4組：空白組、模型組、埋線組和西藥組，每組各20只，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，準(zhǔn)備進(jìn)行模型制作[3]。嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處置。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

氯化鋰 (北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，100 g/瓶，批號(hào)：115K1708)；鹽酸匹羅卡品 (美國Sigma公司，5 g/瓶，批號(hào)：096k1730)；硫酸阿托品 (遂成藥業(yè)股份有限公司，0.5 mg/瓶，批號(hào)：H41031257)；左乙拉西坦(UCB Pharma S.A.,0.5 g/片，批號(hào)：H20170254)。

1.3 模型制備

分組后第1天15：00，在清醒狀態(tài)下對(duì)模型組大鼠腹腔注射氯化鋰溶液(127 mg/kg)，第2天上午09：30腹腔注射硫酸阿托品溶液(1 mg/kg)，以減輕匹羅卡品所引起的外周不良反應(yīng)；同日10：00再次腹腔注射匹羅卡品溶液，20 mg/kg為首次給藥的劑量[5]。隨后密切觀察大鼠的行為學(xué)變化，按表1中的Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)估大鼠癲癇的發(fā)作強(qiáng)度，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠在給藥后1 h內(nèi)出現(xiàn)Ⅳ級(jí)～Ⅴ級(jí)發(fā)作。若大鼠發(fā)作未達(dá)到IV～V級(jí)，則每隔30 min給予腹腔注射匹羅卡品1次(10 mg/kg)，注射達(dá)極量50 mg/kg后，僅出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以下一過性發(fā)作則視為未點(diǎn)燃，予淘汰處理。若大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)超過1 h或出現(xiàn)脫水的癥狀，立即腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)止癇以降低死亡率，若效果不佳則30 min后補(bǔ)注射1次。

表1 Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 干預(yù)方法

正常組和模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.4.1 西藥組 予左乙拉西坦混懸液灌胃，180 mg/kg(相當(dāng)于人類15 mg/kg)每日1次，總計(jì)持續(xù)28 d。

1.4.2 埋線組 參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]對(duì)大鼠的腧穴百會(huì)與大椎進(jìn)行定位，局部脫毛，并用龍膽紫進(jìn)行定標(biāo)，分別在建模成功后的4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(即第1天、7天、14天和21天)進(jìn)行穴位埋線，埋線時(shí)將規(guī)格為4-0的迪棕系膠原蛋白線(江西龍騰生物高科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YY1116-2010)剪為10 mm/段，使用7#一次性埋線針進(jìn)行相關(guān)操作。具體方法：兩人配合，一人左手固定大鼠頭頸部，右手固定大鼠后肢，另一人穿刺埋線。龍膽紫定標(biāo)，穴位處備皮，穴位附近皮膚消毒，l%利多卡因皮內(nèi)麻醉。羊腸線放置于埋線器套管內(nèi)，快速刺入大椎穴與百會(huì)穴。左手拇、食指繃緊或捏起進(jìn)針部位皮膚，右手持針刺入到所需深度后，先稍稍后退針，然后將線體彈入穴位，出針后用消毒干棉球按壓止血。一穴一針進(jìn)行埋線。

1.5 處死及取材

在干預(yù)的第28天，認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，對(duì)所有存活的大鼠進(jìn)行處死取材。麻醉大鼠的方法為10%的水合氯醛5 mL/kg腹腔注射，當(dāng)麻醉起效后，將大鼠用橡皮筋固定于自制的簡易手術(shù)板上并放到解剖盤中，開腹、灌注和斷頭，取海馬、剝離，放置于4%的多聚甲醛溶液，并放入4℃冰箱中過夜。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 制模成功率估算 根據(jù)各組大鼠在建模期間的Racine評(píng)分情況進(jìn)行制模成功率估算。

1.6.2 癲癇發(fā)作程度及平均發(fā)作時(shí)間 干預(yù)后第28天，按照Racine分級(jí)評(píng)定方法，對(duì)所有存活大鼠進(jìn)行時(shí)長為1 h的癲癇發(fā)作程度評(píng)估，并記錄各組大鼠癲癇平均發(fā)作時(shí)間。

1.6.3 拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 干預(yù)前(即建模成功后)及末次干預(yù)后(干預(yù)第28天)，分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行拒俘反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。具體方法為：以大鼠從未接觸過的手套輕抓各組大鼠，觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)記分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.4 尼氏染色 將石蠟切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水后,于尼氏染色液中染色5 min，蒸餾水沖去浮色，依次用 70%、80%、95%及100%的酒精進(jìn)行梯度脫水；入二甲苯中透明2次, 每次5 min，最后用中性樹膠封片[6]，在Olympus 光學(xué)顯微鏡下觀察并半定量評(píng)價(jià)CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞丟失程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 尼氏染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.5 免疫組化法測定海馬BDNF蛋白的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟復(fù)水，DAB顯色，進(jìn)行脫水、透明和中性樹膠封片處理，每張切片于光鏡(400×)下隨機(jī)挑選4個(gè)視野拍照，經(jīng)Image-Pro Plus6.0軟件處理后，對(duì)BDNF的陽性表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 建模成功率

在建模過程中，模型組建模成功的大鼠為17只，其中2只因未達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)而被棄用，1只因癲癇持續(xù)狀態(tài)造成死亡；西藥組建模成功的大鼠為19只，1只因灌胃中出現(xiàn)誤吸而致死；埋線組建模成功的大鼠為18只，有2只因未達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)而被棄用。本次實(shí)驗(yàn)中，共計(jì)60只大鼠參與實(shí)驗(yàn)點(diǎn)燃，有54只被成功點(diǎn)燃，經(jīng)計(jì)算本次建模的成功率達(dá)到了90.0%。

2.2 各組癲癇發(fā)作程度及平均發(fā)作時(shí)間比較

Racine分級(jí)評(píng)分顯示，模型組的大鼠可出現(xiàn)典型癲癇發(fā)作征象(P<0.01)；西藥組、埋線組與模型組大鼠相比較，其癲癇發(fā)作程度明顯減輕，平均癲癇發(fā)作時(shí)間亦明顯減少(P<0.05)；而將西藥組與埋線組進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組癲癇發(fā)作程度及平均發(fā)作時(shí)間比較

2.3 各組拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)比較

通過拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分可知，相較于空白組，模型組的大鼠攻擊行為和逃避行為明顯增多(P<0.01)；西藥組、埋線組較模型組大鼠攻擊行為和逃避行為顯著減少(P<0.05)；而將西藥組與埋線組進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較

2.4 各組尼氏染色結(jié)果比較

圖1示尼氏染色后，空白組的海馬區(qū)可見大量神經(jīng)細(xì)胞，排列致密，形態(tài)正常，胞漿內(nèi)有豐富的尼氏小體，未見核固縮等神經(jīng)元變性受損特征。與空白組進(jìn)行比較可知，模型組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，排列稀疏，細(xì)胞形態(tài)不正常，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，神經(jīng)元受損特征明顯。埋線組與西藥組神經(jīng)元受損程度較模型組輕，但在組織形態(tài)上與空白組仍有一定差距。

表6反應(yīng)的是各組鏡下半定量評(píng)分情況?？梢娍瞻捉M光鏡下CAl區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞丟失程度半定量評(píng)分為0分，基本無損害，模型組、西藥組、埋線組的評(píng)分顯示有不同程度的損傷。與空白組比較，模型組評(píng)分顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、埋線組評(píng)分顯著下降(P<0.05) ，而兩組間比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 尼氏染色后結(jié)果比照(400×)

圖2 各組免疫組化下BDNF表達(dá)(400×)

表6 各組CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失程度光鏡下半定量分析評(píng)分

2.5 各組海馬BDNF蛋白表達(dá)比較

通過圖2可知，與空白組比較，模型組大鼠海馬BDNF免疫陽性細(xì)胞著色明顯，突起的染色加深，高倍視野下模型組大鼠海馬BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目為(16.85±3.49)個(gè)，明顯少于空白組的(30.57±2.14)個(gè)(P<0.05)；經(jīng)西藥及穴位埋線干預(yù)后海馬中BDNF表達(dá)均較模型組增高(P<0.05)，其中埋線組BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目(24.23±2.29)個(gè)，西藥組(25.57±2.23)個(gè)，而西藥組與埋線組組間比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

腦神經(jīng)元的高度同步化異常放電會(huì)引起癲癇，導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失或者神經(jīng)細(xì)胞的損害[6-9]。而神經(jīng)元的缺失不僅僅會(huì)加重癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度[10]，更會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。本實(shí)驗(yàn)所選用的氯化鋰-匹羅卡品建造癲癇大鼠模型的方法是目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的與人類顳葉癲癇具有相似特征的致癇鼠模型[11-12]，長期反復(fù)發(fā)作的-顳葉癲癇可引起認(rèn)知障礙[13]。大腦中主要參與學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能形成的部位是海馬[14]，該部位是癲癇對(duì)認(rèn)知功能影響的理想部位。

拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可以用于測評(píng)大鼠的認(rèn)知情感行為；尼氏染色則可以直觀觀察海馬相應(yīng)區(qū)域的神經(jīng)元丟失及損傷的程度。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠的自發(fā)性癲癇會(huì)有反復(fù)發(fā)作的傾向，可以引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減退；根據(jù)尼氏染色及鏡下半定量評(píng)分結(jié)果可知，癲癇會(huì)引起大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元大量丟失并導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力的下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，由此證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功。有研究表明，BDNF可能直接參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能，本實(shí)驗(yàn)的免疫組化結(jié)果表明，埋線組與西藥組的BDNF蛋白表達(dá)較模型組明顯增加，提示穴位埋線可以減少神經(jīng)元丟失程度、提升海馬中BDNF蛋白的含量，進(jìn)而可以改善癲癇后認(rèn)知情況。

中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論認(rèn)為，癲癇的病機(jī)主要是督脈經(jīng)氣阻滯、氣血逆亂，治宜醒腦開竅、平衡陰陽。督脈被認(rèn)為是“陽脈之?！?，對(duì)整個(gè)經(jīng)絡(luò)、氣血均具有調(diào)節(jié)作用。百會(huì)穴為治療癲癇的要穴[15-17],中醫(yī)學(xué)認(rèn)為頭為“諸陽之會(huì)”“諸經(jīng)皆通于腦”。百會(huì)穴位于巔頂，其深處即為腦之所在，為調(diào)節(jié)腦部功能之要穴，穴性屬陽，又于陽中寓陰，為百脈之會(huì)，貫達(dá)全身，系平衡陰陽之要穴，配合“大椎穴”可增強(qiáng)疏通經(jīng)絡(luò)、行血化滯和調(diào)節(jié)督脈氣機(jī)之功效，既可熄風(fēng)寧神、緩解癲癇癥狀，又可開竅醒腦、改善認(rèn)知狀況。

縱觀整個(gè)操作流程，穴位埋線集合了包括針刺、刺血、留針與穴位封閉等在內(nèi)的中醫(yī)多種刺激反應(yīng)[18-21]。這些反應(yīng)相互配合,共同起效,可以形成一種非特異性刺激沖動(dòng)，此種沖動(dòng)持久柔和而復(fù)雜,一部分抑制臟腑內(nèi)作用，一部分通過神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)來調(diào)整臟腑，最終達(dá)到治愈疾病的作用[22]。穴位埋線使得癲癇及癲癇后認(rèn)知損害有了方便而有效的治療方法。

穴位埋線能克服癲癇發(fā)作時(shí)不易針灸的弊端，且操作治療無需每日均進(jìn)行，可減輕患者疼痛感與緊張感，安全且?guī)缀鯚o副作用；埋線百會(huì)還能起到腦保護(hù)的作用，對(duì)癲癇后認(rèn)知障礙有改善作用。

總之，使用“大椎”“百會(huì)”穴位埋線療法，可以減少海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而改善癲癇大鼠認(rèn)知狀況，但其具體作用的靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。