林蛙油凍干粉對大鼠肺纖維化藥理作用及其機制的研究

李孟，呂邵娃，管慶霞，郭玉巖，楊炳友,張鳳春，李永吉，匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江四寶生物科技股份有限公司，黑龍江 鐵力 152500)

2020年新型冠狀病毒感染的肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在全世界范圍內(nèi)肆虐，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第八版)》[1-2]指出感染者的胸部影像學(xué)特點：早期呈多發(fā)小斑片影像伴有間質(zhì)改變，肺外帶處明顯，可進一步發(fā)展為雙肺多發(fā)磨玻璃樣浸潤影。研究顯示[3]，基礎(chǔ)病明確的患者影像中，多呈現(xiàn)為雙肺彌漫性病變，少數(shù)表現(xiàn)為“白肺”樣，并伴多發(fā)條索狀陰影，由于急性期大量肺間質(zhì)炎性滲出，會造成嚴重的肺部纖維化[4-5]，肺纖維化也是老年人常見的一種難以治愈的疾病。因此，改善肺纖維化是有效的緩解癥狀的方式及治療的手段。林蛙油別名哈士膜油，是東北地區(qū)特色藥材，為林蛙的干燥輸卵管，收載于歷年的《中國藥典》之中，具有補腎填精、養(yǎng)陰潤肺的作用，根據(jù)黑龍江省七臺河市人民醫(yī)院和牡丹江紅旗醫(yī)院等臨床報告顯示，對新冠肺炎的患者給予林蛙油凍干粉輔助治療，對體質(zhì)虛弱、癆嗽咳血等癥效果顯著，還可以改善陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠等。然而林蛙油凍干粉是否具有改善肺纖維化的作用未見報道，本文以林蛙油凍干粉[6]為研究對象，考察林蛙油凍干粉對大鼠肺纖維化的藥理作用，為林蛙油凍干粉臨床防治肺纖維化疾病的提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD品系大鼠，體質(zhì)量200～220 g。青島市實驗動物和動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(魯)20140001。

1.2 藥物與試劑

林蛙油凍干粉(黑龍江四寶生物科技股份有限公司，批號20191101)；HYP試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；MDA試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；SOD試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；GSH-Px試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；CAT試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；TNF-α試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；IL-6試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；IL-7試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)。

1.3 實驗儀器

101A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實驗儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表)；VICTOR X3酶標儀(PerkinElmer公司)；TDL-4型低速臺式離心機(上海安享科學(xué)儀器廠)；108 mL手動組織勻漿器(天津玻璃儀器廠)；H2050R型臺式高速冷凍離心機(湖南實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.4 分組與給藥

取雄性SD大鼠63只，隨機分為7組。實驗室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。大鼠均以基礎(chǔ)飼料和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。隨機分為：①正常對照組(生理鹽水灌胃1 mL/d),②假手術(shù)組(生理鹽水灌胃1 mL/d),③模型組(博萊霉素5 mg/kg),④林蛙油凍干粉低劑量干預(yù)組(0.05 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑤林蛙油凍干粉中劑量干預(yù)組(0.10 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑥林蛙油凍干粉高劑量干預(yù)組(0.20 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑦潑尼松組(0.005 g/kg)。

②～⑦組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)，大鼠麻醉后，切開頸正中部位并暴露氣管，③～⑦組由氣管向內(nèi)注入溶解了博萊霉素A5(5 mg/kg)的生理鹽水0.2 mL，向②組注入等量生理鹽水，然后各組大鼠均直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布在肺內(nèi)。次日，①～③組2 mL生理鹽水灌胃，④～⑦組灌胃給藥，每日1次。

1.5 觀察指標

血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度測定，肺組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的測定，同時觀察肺纖維化大鼠肺組織病理學(xué)改變和HYP水平的變化情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 林蛙油凍干粉對肺纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度的影響

灌胃28 d后，大鼠麻醉后開胸，以心臟采血法采集血液3 mL，離心并提取血清， ELISA法測定各組血清TNF-α、IL-6、IL-17 濃度。結(jié)果見表1。

表1 各組間血清TNF-α、IL-6、IL-17含量變化情況比較

從表1可知：模型組與正常對照組、假手術(shù)組比較， TNF-α含量、IL-6含量、IL-17含量升高并有顯著性差異，證明其造模成功。

林蛙油凍干粉各給藥組與模型組比較，TNF-α含量降低且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉可以明顯減少炎癥的發(fā)生，抑制致炎因子TNF-α的表達。IL-6含量降低均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油凍干粉可以明顯抑制致炎因子IL-6的表達。IL-17含量降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉高劑量組可明顯降低炎癥細胞因子IL-17的產(chǎn)生。

2.2 肺組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的測定

頸動脈放血將大鼠處死，取右側(cè)肺部組織后迅速置于-80 ℃液氮中凍存，檢測丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)含量。檢測時，取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，測定MDA、SOD、GSH-Px、CAT的含量。結(jié)果見表2。

表2 各組肺組織MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量變化情況比較比較

結(jié)果表明：模型組與正常對照組、假手術(shù)組比較，MDA含量升高并具有顯著性差異。林蛙油凍干粉各給藥組與模型組比較，含量降低且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉組對肺系統(tǒng)損傷程度有明顯降低作用。林蛙油凍干粉低劑量組與模型組比較，SOD含量升高且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉低劑量組可明顯消除生物體在新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。林蛙油凍干粉中劑量和高劑量組與模型組比較，GSH-Px含量升高并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油凍干粉中劑量和高劑量可以保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能；CAT含量升高并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，表明林蛙油凍干粉清除自由基能力強，具有保護細胞免受自由基的損傷的作用。

2.3 林蛙油凍干粉對肺纖維化大鼠肺組織病理學(xué)改變和HYP含量的影響

將10 %中性福爾馬林液經(jīng)主支氣管注入左肺，并使胸膜展開。而后將其放入10 %中性福爾馬林液中固定24 h以上，用石蠟包埋，切片，HE染色及Masson染色[7]。用HE染色評定肺組織肺泡的炎癥程度：0分為無肺部組織炎；1分為輕度的肺部組織炎，炎性細胞浸潤僅為局部或近胸膜部，其面積小于全肺的20%；2分為中度肺部組織炎，其炎性受累面積約占全肺地20%～50%；3分為重度肺部組織炎，其受累的面積大于50%。Masson染色評定肺組織纖維化程度：0分：無肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，受累面積少于全肺20%；2分：中度肺纖維化，受累面積占20%～50%；3分：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。結(jié)果見圖1和圖2。取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，采用試劑盒測定HYP含量，見表3。

表3 肺部炎癥和纖維化的比較分數(shù)和HYP含量

圖1和圖2結(jié)果表明：正常對照組、假手術(shù)組的大鼠肺部組織結(jié)構(gòu)清晰，無病理改變；模型組的肺泡間隔明顯地增厚，多數(shù)大鼠肺泡壁的結(jié)構(gòu)紊亂，較多炎癥細胞浸潤，肺部纖維化明顯；林蛙油凍干粉組上述病變明顯減輕。

注：A:正常對照組B:假手術(shù)組C:模型組D:林蛙油凍干粉低劑量組E:林蛙油凍干粉中劑量組F:林蛙油凍干粉高劑量組G:潑尼松組。圖1 HE肺組織染色圖(×20)

注：A：正常對照組 B：假手術(shù)組 C：模型組 D：林蛙油凍干粉低劑量組 E：林蛙油凍干粉中劑量組 F：林蛙油凍干粉高劑量組G：潑尼松組。圖2 Masson肺組織染色圖(×20)

由表3可知，林蛙油凍干粉低劑量和中劑量組與模型組比較，肺泡炎、肺纖維化評分及肺組織HYP含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明林蛙油凍干粉低劑量和中劑量組可減輕肺纖維化及肺泡炎程度。

3 討論

肺纖維化是由多種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的慢性、間質(zhì)性肺疾病，是一種致命的肺部疾病，病理表現(xiàn)為肺泡上皮細胞的損傷和異常增殖，大量細胞外基質(zhì)的沉積和成纖維細胞的增殖和活化[8-10]，導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)破壞和呼吸功能的喪失。肺纖維化的死亡率較高，據(jù)近5年數(shù)據(jù)顯示，患者的平均生存周期僅為2.8 年，死亡率較大多數(shù)腫瘤疾病高，有“類腫瘤疾病”[11]之稱。肺纖維化的形成和發(fā)展過程復(fù)雜，機制不明，但既往的研究提示氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)在其疾病的發(fā)展中具有重要作用[12]。近年來，肺纖維化發(fā)病率呈上升趨勢，因此尋找安全有效藥物治療已成為迫切需要。

TNF-α可誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生多種炎癥因子[13]，激發(fā)炎癥的產(chǎn)生。IL-6、IL-17是由多種細胞產(chǎn)生并作用于的一類細胞因子，能在急性炎癥反應(yīng)中誘導(dǎo)急性期地反應(yīng)蛋白合成。這幾類均為導(dǎo)致肺損傷地重要的致炎因子，抑制其產(chǎn)生能夠在一定程度上緩解肺纖維化炎癥細胞浸潤、活化，改善細胞因子異常分泌，以及肺部纖維化的病理過程。林蛙油凍干粉可有效抑制TNF-α的產(chǎn)生，明顯減緩肺纖維化炎癥細胞活性。

丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，當機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，自由基產(chǎn)生過多，超過了機體的清除能力，使氧化/抗氧化處于失衡狀態(tài)。MDA的含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。林蛙油凍干粉可有效降低機體MDA的含量，對系統(tǒng)損傷程度有明顯降低作用。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶都是內(nèi)源性抗氧化酶，可反映機體清除氧化自由基的能力。GSH-Px作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，當與一定物質(zhì)結(jié)合后，可把機體內(nèi)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)為無害物質(zhì)，并將其排出體外。CAT的主要作用就是將H2O2催化分解變成H2O與O2，使H2O2不至于與O2反應(yīng)產(chǎn)生有害的·OH，能夠?qū)C體產(chǎn)生保護作用。林蛙油凍干粉可使細胞SOD含量、GSH-Px含量、CAT含量升高，可明顯消除生物體在新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，可保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，清除自由基的能力變強，具有保護細胞免受自由基損傷的作用。

羥脯胺酸是脯氨酸羥化酶催化前α-肽鏈中脯氨酸殘基而形成，主要存在于膠原中，當體內(nèi)結(jié)締組織大量增生或破壞時均可造成血、尿中羥脯氨酸含量的增加，因此羥脯氨酸含量降低可代表炎癥癥狀減輕。林蛙油凍干粉可使HYP含量明顯降低，具有減輕肺纖維化及肺泡炎的積極意義。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明林蛙油具有抗衰老、抗疲勞等藥理作用[14-16]。還可提高機體免疫功能和應(yīng)激性能，含有極其豐富的 Vit E[17]。林蛙油本身就具有多種使用方法，除燉服外,口服需泡發(fā)后使用，泡發(fā)周期長，而林蛙油凍干粉更是質(zhì)地疏松，泡發(fā)后迅速膨脹為原始體積的100倍以上，經(jīng)多方實驗參數(shù)所制得的林蛙油凍干粉具有含水量低、復(fù)水性好、質(zhì)量穩(wěn)定、使用方便等特點。林蛙油凍干粉為林蛙油的廣泛應(yīng)用提供了更為便捷、更為有效的途徑。

本研究結(jié)果表明，林蛙油凍干粉可在一定程度抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其機制與減輕炎癥反應(yīng)同時增強機體抗氧化能力有關(guān)，該結(jié)果的揭示為臨床的用藥提供了藥理學(xué)的依據(jù)。雖然目前尚缺乏針對新冠肺炎后肺間質(zhì)纖維化傾向地大樣本的臨床研究，但本文為探討林蛙油治療新冠肺炎后肺間質(zhì)纖維化傾向疾病提供了理論支持。