小鼠外翻腸囊法初探左金丸中季胺型生物堿的腸吸收特性

吳迪,高原,楊娜娜,韓曉宇,劉樹森,孫文斌,王旭,徐蓓蕾*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.北京鑫開元醫(yī)藥科技有限公司，北京 101102)

左金丸出自《丹溪心法·火六》，主治肝經(jīng)火旺之證，后世醫(yī)家多用于肝火犯胃、胃氣上逆之脅肋脹痛、嘔吐吞酸、噯氣口干、舌紅苔黃、脈象弦數(shù)等癥[1]。伍曙霞[2]研究表明,左金丸結(jié)合養(yǎng)胃湯可以用來治療慢性萎縮性胃炎，并具有明顯的治愈效果。常用于治療肝火犯胃，肝胃不和證?，F(xiàn)代臨床多用于胃炎、食道炎、胃潰瘍等屬肝火犯胃者。本次實驗主要針對左金丸中的季胺型生物堿進(jìn)行研究，考察其在小鼠腸囊中的吸收特性。

1 材料

1.1 動物

ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，合格證編號：20180613。

1.2 藥物與試劑

黃連、吳茱萸藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場；小檗堿、藥根堿、巴馬汀對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：120620、120423、110311；乙腈、甲醇為Merck公司，色譜純。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific)；紫外檢測器(UltiMate?3000 ECD3000RS)；電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司，DK-98-11A)。

2 方法

2.1 K-R試液(腸液)的配置

精確稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，溶解定容至1 000 mL容量瓶中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2[3]。

2.2 對照品溶液制備

取小檗堿、藥根堿對照品適量，加入適量的甲醇，制成濃度為0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL的對照品備用；取巴馬汀對照品適量，加入適量的甲醇，制成濃度為0.00 1mg/mL、0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL的對照品備用。

2.3 左金丸藥液制備

按黃連和吳茱萸的比例為6:1稱取生藥，先用10倍蒸餾水浸泡0.5 h，熬制1 h后，將濾液濾出，后加入8倍量的蒸餾水繼續(xù)熬制0.5 h，后將藥液濾出，與之前濾出的藥液混合，蒸發(fā)濃縮后熬制成浸膏[4]。將浸膏溶于Krebs-Ringer’s試液中，得到濃度分別為 422.74、211.37、105.685 mg/mL的左金丸藥液，作為本實驗的高、中、低劑量組。

2.4 HPLC色譜條件

高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，按每100 mL/0.4 g十二烷基硫酸鈉，溶于比例為50∶50的乙腈和水的混合溶液中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，形成以乙腈-水(含0.05 mol/L磷酸二氫鉀)溶液的流動相。選擇吸收度最大的345 nm波長作為測定波長。

2.5 外翻腸囊法測定小腸吸收面積

ICR小鼠實驗前禁食不禁水12 h，稱重，以水合氯醛麻醉，沿小鼠的腹中線和腹白線剖開，迅速將整個腸段離體，清理腸表面組織和血管。將腸道分段成5～7 cm左右4個腸段，用37 ℃的Krebs-Ringer’s試液進(jìn)行沖洗，至腸內(nèi)無內(nèi)容物為止。將腸段翻轉(zhuǎn)，用冰冷Krebs-Ringer’s試液沖洗腸段表面，將腸段固定，另一端用絲線扎緊，形成腸囊。在腸囊中注入1 mL左右的37 ℃ Krebs-Ringer’s試液，將腸囊放至37 ℃ Krebs-Ringer’s試液EP管中，平衡五分鐘[5]。后放入含不同濃度的左金丸Krebs-Ringer’s溶液的EP管中，通入95%的O2與5%的CO2混合氣體，調(diào)節(jié)氣流0.02 MPa。實驗需在37 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行，分別在0 min、20 min、40 min、60 min、90 min取樣200 μL后，補(bǔ)充等體積的空白37 ℃的Krebs-Ringer’s試液。抽取腸囊內(nèi)的樣品后過0.22 μm有機(jī)濾膜，在-20 ℃溫度下保存。實驗結(jié)束后，記錄每段腸囊的吸收面積A。

2.6 數(shù)據(jù)分析

累計藥物吸收量公式[6]：

其中Q為各時間的累積藥物吸收量，Cn為各時間點取樣的實際檢測濃度(μg/mL)，V0為平衡前腸管中加入的臺氏液體積(mL)，V為每次取樣的體積(mL)，L為藥物的累積吸收量對時間作相關(guān)回歸分析得出的斜率，A為腸段吸收表面積(cm2)

表觀滲透系數(shù)用公式：

Papp=ΔQ/Δt×A×C0

吸收速率常數(shù)[Ka,μg/(min·cm)]的計算公式：

Ka=L/A

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取“2.2”項下方法配置的對照品溶液，按照“2.4”項下色譜條件進(jìn)行測定。記錄色譜圖，以峰面積為橫坐標(biāo)，以濃度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為：小檗堿：y=0.000 8x+0.000 4，R2=0.998 9；藥根堿：y=0.000 6x+0.000 1，R2=0.999；巴馬?。簓=0.000 9x-0.001 4，R2=0.994 5。小檗堿、巴馬汀、藥根堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 小檗堿、巴馬汀、藥根堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3.2 精密度考察

將小檗堿、藥根堿、巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定日內(nèi)精密度，再分別將對照品第1、3、5天內(nèi)各測定1次，測定日間精密度。日內(nèi)精密度分別為：

1.48%、1.65%、1.37%，日間精密度分別為：1.23%、1.39%、0.42%。

3.3 穩(wěn)定性考察

精密吸取各劑量中的同一小鼠的同一段腸囊中的供試品溶液20 μL，分別于0～24 h內(nèi)測定小檗堿、藥根堿、巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品峰面積，得RSD值分別為：1.82%、0.81%、0.44%。說明小檗堿、藥根堿、巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定，符合實驗要求。

3.4 腸內(nèi)樣品含量測定結(jié)果

取供試品溶液20微升進(jìn)高效液相，按照“2.4”項下條件進(jìn)行測定，樣品的色譜圖見圖2。

圖2 樣品色譜圖

將得到的峰面積值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算出其中的各組分的濃度，用2.6項下公式計算出濃度、平均吸收藥量ΔQ和Papp值的±s，以時間為橫坐標(biāo),以累計吸收量為縱坐標(biāo),得到吸收速率常數(shù)K，結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著時間的增加，小檗堿、巴馬汀、藥根堿的平均吸收量均Q值逐漸增加，隨著濃度的增加,高、中、低3個劑量組的吸收量增加幅度明顯，接近成倍增加，符合濃度增加1倍吸收增加量增加近1倍的吸收特性。3種生物堿的Papp值隨濃度的增加呈逐漸增大的趨勢。在同一腸段中，3種生物堿的Papp值隨時間的增加在20～40 min時有所降低，在40 min后趨于穩(wěn)定。

表1 3種生物堿不同時間、不同濃度在腸囊內(nèi)的ΔQ值與Papp值及吸收速率常數(shù)K值

以時間(min)為橫坐標(biāo)、以累計吸收量Q(μg)為縱坐標(biāo)得到濃度對吸收量的曲線所得K值，見圖3。圖3-1為小檗堿3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為0.97、0.98、0.98。圖3-2為巴馬汀3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為 0.98、0.95、0.98。圖3-3為藥根堿3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為0.99、0.96、0.94。由所得K值均大于0.9可以看出三種生物堿的腸吸收均為零級吸收，隨時間與濃度的增加吸收量值逐漸增大，具有一定的線性關(guān)系，符合被動轉(zhuǎn)運(yùn)吸收方式[7]。

圖3 3種生物堿不同濃度對吸收量的曲線所得K值

4 討論

外翻腸囊模型是一種極為簡單而又快速檢查藥物吸收以及確認(rèn)腸道代謝的方法，廣泛應(yīng)用于小腸吸收的研究。本實驗采用外翻腸囊法結(jié)合高效液相色譜法，檢測左金丸浸膏中的小檗堿、藥根堿、巴馬汀含量，實驗得到的吸收結(jié)果與體內(nèi)藥物吸收的真實水平接近。并且其吸收成分的種類少于湯中的成分，因此與藥物的譜效相關(guān)分析相比較，外翻腸囊法所注重的是藥物與機(jī)體的相互影響，并且此方法的結(jié)果分析難度較低。左金丸的主要化學(xué)成分在外翻腸囊中主要的吸收過程為累積吸收，在此過程中極少受其他因素如分布、代謝及排泄等過程的影響，并且可以避免對檢測條件要求高的弊端，因此利用外翻腸囊法進(jìn)行研究可以為譜效相關(guān)的研究提供依據(jù)。

本次實驗采用ICR小鼠，對左金丸中三種生物堿成分進(jìn)行了腸吸收研究，通過外翻腸囊法研究發(fā)現(xiàn),左金丸中3種生物堿成分在小鼠腸囊內(nèi)的吸收K值均大于0.9,說明3種成分均為零級吸收。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿、巴馬汀、藥根堿三種生物堿在同一時間段內(nèi)平均吸收量ΔQ隨濃度的增大而增加，同時Papp值也隨濃度的增加而呈增加趨勢。在同一濃度下，隨著孵育時間的延長單位面積的平均吸收量ΔQ增加，表觀分布系數(shù)Papp值會隨時間的延長而減小最后趨于穩(wěn)定。Papp值的減少可能是腸上留有的活性蛋白，其對于藥物的擴(kuò)散具有促進(jìn)或抑制作用。此外還可能與腸囊內(nèi)外溶液濃度差逐漸縮小，腸囊內(nèi)濃度逐漸飽和有關(guān)。不同劑量，面積大小幾乎相等的腸段高劑量實驗組的累積吸收藥量明顯高于中、低劑量實驗組，符合前期的設(shè)想：左金丸中小檗堿在腸內(nèi)的吸收過程主要與腸囊的面積、藥液濃度以及吸收時間有關(guān)。

已知某些藥物在小腸中具有優(yōu)先吸收位點，了解此類口服藥物的主要吸收部位對于開發(fā)理想的藥物產(chǎn)品以及實現(xiàn)臨床有效和可靠的藥物治療非常重要[8-12]。因此，研究藥物在體內(nèi)的吸收過程具有重要的意義，同時，此項研究還可以為藥物體內(nèi)分布，代謝等研究提供一定的依據(jù)。