低氧/低氧誘導(dǎo)因子-1α通過TGF-β1誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

楊再興，梁艷，劉東紅，張振成，羅婉婉，毛盼瓔

1.臺州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 臺州 318020；2.上海長征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（intrahepatic biliary epithelial，IBEC）炎癥性損傷為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性膽汁淤積性肝病，最終會緩慢進(jìn)展為肝硬化、肝癌。PBC病因不 清，早期癥狀隱匿，患者出現(xiàn)癥狀至醫(yī)院就診時(shí)往往已出現(xiàn)明顯肝纖維化甚至肝硬化，但PBC由炎癥向纖維化發(fā)展的機(jī)制至今尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)室和其他國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，PBC患者的IBEC存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）現(xiàn)象，這種轉(zhuǎn)化可能是PBC由炎癥向纖維化過渡的一個(gè)重要機(jī)制[1-3]。

低氧是公認(rèn)的各種肝纖維化疾病肝組織中廣泛存在的現(xiàn)象，在PBC患者肝組織門管區(qū)也存在低氧情況[4]，但低氧是否與IBEC發(fā)生EMT有關(guān)，國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬深入探討低氧是否可以誘導(dǎo)人IBEC（human IBEC，HIBEC）發(fā)生EMT，并闡釋其可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑、耗材 HIBEC購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Fisher Scientific公司；TGF-β1 ELISA檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司；高純總RNA快速提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix、 ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix和Exfect?2000 轉(zhuǎn)染試劑購自南京諾唯贊生物科技公司；CFX connect Real-Time PCR System定量PCR儀及其配套使用分析軟件為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；polycarbonate membranes chambers為美國Corning公司產(chǎn)品；TGF-β1抑制劑（LY364947）購自美國Selleck公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、S100A4抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體、羊抗兔和羊抗鼠二抗購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司；PVDF膜為美國Millipore 公司產(chǎn)品；Tris和甘氨酸購自美國Amresco公司；過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）和四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-Tetramethylethylenediamine，TEMED）購自美國Sigma公司；ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、免疫印跡用細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；臺式高速冷凍離心機(jī)為湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；臺式低速離心機(jī)為湖南凱達(dá)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)和ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；Merinton SMA4000高精度分光光度計(jì)購自北京美林恒通科技有限公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；SpectraMax Plus 384型全波長酶標(biāo)儀為美國MD公司產(chǎn)品。

1.3 HIF-1α siRNA設(shè)計(jì)合成 共設(shè)計(jì)合成3條HIF-1α siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司完成，靶序列分別為，1#：CATGAGGAAATGAGAGAAA；2#：GATGG AAGCACTAGACAAA；3#：CCTCAGTGTGGGTATAAGA。1.4 方法 HIBEC細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)， 0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔2×105的濃度，接種6孔板，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，并列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 PCR實(shí)驗(yàn)：利用Exfect?2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA，以轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對照（NC），24 h后，提取總RNA，行定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞分組：常氧組，常氧培養(yǎng)72 h；低氧組，常氧培養(yǎng)48 h后，低氧培養(yǎng)24 h；NC組，轉(zhuǎn)染空載體后常氧72 h；NC+低氧組，轉(zhuǎn)染空載體后常氧48 h，低氧培養(yǎng)24 h；siRNA組：轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后常氧培養(yǎng)72 h；siRNA+低氧組，轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后常氧培養(yǎng)48 h后，低氧培養(yǎng)24 h；低氧+LY364947組，常氧培養(yǎng)48 h后，加入終濃度5 μg/mL的LY364947并低氧培養(yǎng)24 h。上述的低氧是指氧濃度1%。

1.4.3 劃痕實(shí)驗(yàn)：以最后24 h的開始記為0 h，劃痕后立即40倍拍照，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，再次40倍拍照，測量計(jì)算各組細(xì)胞愈合率來反映細(xì)胞遷移情況，計(jì)算方法如下：細(xì)胞遷移率=（1-24 h后刮痕面積/0 h刮痕面積）×100%。

1.4.4 侵襲實(shí)驗(yàn)：待轉(zhuǎn)染48 h收集各組細(xì)胞，用含2% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，以5×104的密度接種24孔板Transwell小室的上室，下室加入500 μL 的含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，再分別進(jìn)行常氧或低氧培養(yǎng)24 h，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定后，棉簽擦去小室膜上層細(xì)胞，經(jīng)結(jié)晶紫染色，200倍拍照，記數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4.5 TGF-β1含量檢測：分別收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液，參照試劑盒說明書進(jìn)行ELSIA法檢測。1.4.6 HIF-1α、E-cadherin、S100A4蛋白及HIF-1α mRNA檢測：分別收集相應(yīng)組別細(xì)胞，提取總蛋白，免疫印跡檢測HIF-1α、E-cadherin、S100A4蛋白表達(dá)；提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，熔解曲線70～95 ℃；2-ΔΔCt分析HIF-1α基因的mRNA變化。引物信息見表1。

表1 HIF-1α和β-actin的引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α siRNA的干擾效果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3條HIF-1α的siRNA對HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有明顯抑制作用，且3#效果最優(yōu)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用3#進(jìn)行HIF-1α基因沉默。見圖1。

2.2 低氧通過HIF-1α誘導(dǎo)HIBEC發(fā)生EMT 為排除轉(zhuǎn)染本身對結(jié)果的可能干擾，本實(shí)驗(yàn)中所有未轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA的研究組均轉(zhuǎn)染了空載體作為NC。結(jié)果顯示，1%氧濃度的低氧培養(yǎng)24 h后，HIF-1α表達(dá)明顯升高，HIF-1α siRNA可以明顯抑制HIF-1α的表達(dá)；低氧可以誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)明顯降低，S100A4 明顯升高，應(yīng)用siRNA抑制HIF-1α后，則有明顯逆轉(zhuǎn)（見圖2）。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，低氧培養(yǎng)后，HIBEC遷移率明顯增加，加入HIF-1α siRNA后，HIBEC遷移率明顯下降（P＜0.05，見圖3、表2）。Transwell檢測結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)后，侵入小室底膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于常氧培養(yǎng)，加入HIF-1α siRNA后，侵入細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05，見圖4、表2）。

2.3 低氧通過HIF-1α上調(diào)HIBEC對TGF-β1的表達(dá)和分泌 與常氧培養(yǎng)相比，低氧培養(yǎng)HIBEC細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基上清液中的TGF-β1 水平均明顯增加，用siRNA抑制HIF-1α后，HIBEC細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基上清液中TGF-β1水平均明顯下降（P＜0.05，見表3）。

圖1 3條siRNA對HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平的抑制效果

圖2 干擾HIF-1α對低氧誘導(dǎo)EMT相關(guān)指標(biāo)變化的影響

2.4 低氧/HIF-1α對HIBEC EMT的誘導(dǎo)作用部分依賴于TGF-β1 應(yīng)用TGF-β1抑制劑LY364947，可以明顯抑制低氧/HIF-1α對HIBEC的以下作用：上調(diào)Ecadherin、下調(diào)S100A4蛋白表達(dá)，提高HIBEC遷移和侵襲能力（P＜0.05，見圖5-7、表4），但抑制TGF-β1對低氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)增加沒有明顯影響。

圖3 干擾HIF-1α對低氧誘導(dǎo)HIBEC遷移率變化的影響（×40）

圖4 干擾HIF-1α對低氧誘導(dǎo)HIBEC侵襲性變化的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

表2 干擾HIF-1α對低氧誘導(dǎo)HIBEC遷移和侵襲的影響（每組n=3）

表3 干擾HIF-1α對低氧誘導(dǎo)HIBEC表達(dá)和分泌TGF-β1水平的影響（每組n=3，pg/mL）

圖5 抑制TGF-β1對低氧誘導(dǎo)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

3 討論

EMT是上皮細(xì)胞表型和生物學(xué)特性發(fā)生變化，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，上皮細(xì)胞具有緊密連接、極性、不能移動等性質(zhì)，其主要標(biāo)志物是Ecadherin蛋白；而間質(zhì)細(xì)胞則失去緊密連接，無極性，可移動，增殖力、遷移力和侵襲性均顯著增強(qiáng)，其主要標(biāo)志物是S100A4（也稱為成纖維細(xì)胞特異蛋白1）等[5-7]。EMT現(xiàn)象最初是在胚胎中發(fā)現(xiàn)的，是胚胎發(fā)育中的重要調(diào)節(jié)因素，但后來研究表明，EMT也廣泛存在于腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移以及纖維化疾病的形成過程中[8-10]。近來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PBC的IBEC亦會發(fā)生EMT，這一過程對于PBC門管區(qū)纖維化可能具有重要意義[1-3]，但具體機(jī)制尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以通過HIF-1α誘導(dǎo)HIBEC發(fā) 生EMT樣變化，包括E-cadrherin下調(diào)、S100A4上調(diào)、細(xì)胞遷移性和侵襲性增加。低氧是PBC發(fā)生纖維化過程中門管區(qū)廣泛存在的現(xiàn)象，據(jù)推測，低氧與PBC門管區(qū)新生血管增加以適應(yīng)纖維化有關(guān)[4，11-12]， 但低氧對PBC的損傷靶點(diǎn)IBEC的作用情況，國內(nèi)外尚罕有研究。本研究闡釋了低氧對IBEC發(fā)生EMT的誘導(dǎo)作用，從而也為低氧與PBC肝纖維化的關(guān)系提供了一個(gè)新的線索。

圖6 抑制TGF-β1對低氧誘導(dǎo)HIBEC遷移的影響（×40）

圖7 抑制TGF-β1對低氧誘導(dǎo)HIBEC侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

表4 抑制TGF-β1對低氧誘導(dǎo)HIBEC遷移性和侵襲性的影響（每組n=3）

TGF-β1 是與肝纖維化關(guān)系非常密切的一種重要細(xì)胞因子，參與了各種因素引起的肝纖維化、肝硬化過程[13-15]。ZHAO等[16]發(fā)現(xiàn)，脂多糖可以誘導(dǎo)IBEC發(fā)生EMT，TGF-β1在其中扮演了重要角色。本研究表明，在低氧誘導(dǎo)IBEC發(fā)生EMT的過程中，TGF-β1同樣具有重要作用—低氧通過HIF-1α誘導(dǎo)HIBEC表達(dá)和分泌TGF-β1，而抑制TGF-β1明顯阻止或逆轉(zhuǎn)IBEC發(fā)生EMT，且不影響低氧對HIF-1α的活化。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低氧可以通過HIF-1α誘導(dǎo)IBEC發(fā)生EMT，而這一作用主要是通過誘導(dǎo)IBEC分泌TGF-β1實(shí)現(xiàn)的。