高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定紅肉及其加工肉中唾液酸含量

趙 非，陳寶英，李克峰，王 旭,,*

（1.天津科技大學(xué) 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津桑尼匹克生物科技有限公司，天津 300457）

唾液酸是一類9碳單糖的羧酸鹽。它們?cè)谏砩掀鹬喾N重要作用，包括分子間的相互作用、神經(jīng)元的外生長(zhǎng)和記憶形成、細(xì)胞的增殖分化與癌變以及病毒細(xì)菌的感染[1-7]。唾液酸的主要代表形式為N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），是一種?；–5氨基處）化合物。另一種常見的形式為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc），由C5處氨基與羥乙?；Y(jié)合形成（結(jié)構(gòu)見圖1）。唾液酸通常作為糖綴合物的末端殘基被發(fā)現(xiàn)，很少以游離形式出現(xiàn)[8-10]。

圖1 唾液酸結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of sialic acids

近年來，大量流行病學(xué)顯示，紅肉的長(zhǎng)期攝入是一種潛在的癌癥危險(xiǎn)因素[11-12]。有研究[13]表明Neu5Gc作為紅肉中的一種特殊成分與癌癥的發(fā)生有關(guān)。人類在進(jìn)化過程中合成Neu5Gc的關(guān)鍵酶CMAH的基因發(fā)生缺失突變，健康人體內(nèi)不能合成Neu5Gc。但是在人體組織和體液中仍然會(huì)發(fā)現(xiàn)微量Neu5Gc的存在[14-15]，這是由于通過食物攝入的結(jié)合態(tài)Neu5Gc具有生物可利用性，它可以經(jīng)過體內(nèi)代謝結(jié)合到人體組織中[13,16]。Neu5Gc作為外來抗原與抗Neu5Gc抗體的相互作用可能會(huì)引發(fā)炎癥從而增加患癌機(jī)率，這也是研究者普遍認(rèn)為的一個(gè)推測(cè)[17]。

比色法已用于測(cè)定動(dòng)物組織的唾液酸含量，但此方法缺乏特異性，只能夠測(cè)定總唾液酸含量[18-19]。近年來，氣相色譜法[20]、基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜法[21]和安培法[22]被應(yīng)用于唾液酸的分析。但是，目前最常用方法是基于柱前衍生化的高效液相色譜法[10]。特別是4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽（4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride，DMB），作為一種具有高選擇性和少干擾的衍生化試劑已被廣泛用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或液相色譜-熒光法分析唾液酸[23-24]。對(duì)于樣品制備，酸水解是釋放非游離形式唾液酸最常用的方法，通常使用70～90 ℃的溫和酸性條件[25-26]。本研究借助超聲輔助對(duì)前處理和衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，擬建立一種快速測(cè)定Neu5Ac和Neu5Gc的高效液相色譜-熒光檢測(cè)（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法，對(duì)紅肉及其加工制品中的游離和結(jié)合形式的Neu5Ac和Neu5Gc含量進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉（牛肉、豬肉、羊肉）、加工肉（火腿）市售；Neu5Gc、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；DMB 阿拉丁試劑（上海）有限公司；鹽酸、乙酸（均為分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉（分析純） 博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；連二亞硫酸鈉、2-巰基乙醇（均為分析純） 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；所有用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型液相色譜儀（配有熒光、示差、紫外檢測(cè)器）美國(guó)Agilent公司；Hypersil GOLD C18（250 mmh 4.6 mm，5 μm）色譜柱、真空冷凍干燥儀、振蕩恒溫金屬浴 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)373 nm，發(fā)射波長(zhǎng)448 nm；流動(dòng)相為超純水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～7 min，90%～80% A、10%～20% B；7～9 min，80%～10% A、20%～90% B；9 ～1 2 m i n，1 0% A、9 0% B；1 2 ～1 2.1 m i n，10%～90% A、90%～10% B；12.1～17 min，90% A、10% B；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2 衍生化反應(yīng)

1.3.2.1 Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱量10.00 mg的Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品，分別用超純水溶解并定容到10 mL，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的Neu5Ac和Neu5Gc儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)中使用的不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均由標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋。

1.3.2.2 衍生化試劑溶液

精確稱量29.25 mg DMB衍生化物質(zhì)和24.37 mg連二亞硫酸鈉置于10 mL棕色容量瓶中，加入528 μL 2-巰基乙醇和859 μL乙酸后用超純水定容至10 mL。得13 mmol/L DMB、1.5 mol/L乙酸、14 mmol/L連二亞硫酸鈉、0.75 mol/L 2-巰基乙醇的溶液。

1.3.2.3 衍生化條件

取100 μL樣品或者某一質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與100 μL衍生化試劑溶液混勻，避光、50 ℃混勻振蕩動(dòng)態(tài)衍生化120 min，轉(zhuǎn)速450 r/min。冰水浴冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾進(jìn)行色譜分析。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 游離態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac提取

準(zhǔn)確稱取1 g樣品，加入10 mL超純水勻漿后超聲10 min，在13 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.3.2 結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量

準(zhǔn)確稱取1 g樣品，加入10 mL超純水進(jìn)行勻漿，凍干，研磨成粉末。取樣品粉末于離心管中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL，37 ℃水浴30 min，達(dá)到脫乙酰的目的。繼續(xù)加入8 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，80 ℃超聲（功率為180 W）輔助酸解30 min，冰水浴冷卻至室溫。停止反應(yīng)后13 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行衍生化反應(yīng)并分析。最終測(cè)得值減去游離態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量即為結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel以及Origin軟件作圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生化試劑用量

圖2 衍生化試劑用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of sample to derivatization reagent ratio

在8 mmol/L的DMB濃度下對(duì)衍生化試劑用量進(jìn)行優(yōu)化[27-28]。取100 μL 1 μg/mL的Neu5Ac和Neu5Gc混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在標(biāo)準(zhǔn)品溶液與衍生化試劑體積比9∶1、1∶1、1∶2三個(gè)用量下衍生化并進(jìn)行色譜分析。由圖2可見，當(dāng)在混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與衍生化試劑用量體積比為1∶1時(shí)，所測(cè)物質(zhì)的峰面積最高，故選用樣品與衍生化試劑比1∶1作為最優(yōu)的衍生化試劑用量。

2.1.2 衍生化試劑濃度

選取4、8、13 mmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行DMB衍生化試劑濃度的優(yōu)化[13,29-30]。如圖3所示，在4～13 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著DMB試劑濃度的增大，峰面積具有明顯上升的趨勢(shì)，即選用13 mmol/L作為衍生化試劑的最優(yōu)濃度。

圖3 衍生化試劑濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of derivatization reagent concentration

2.1.3 衍生化時(shí)間

將100 μL 1 μg/mL的Neu5Gc和Neu5Ac混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入100 μL 13 mmol/L的DMB衍生化試劑，渦旋混勻。避光、50 ℃條件下分別水浴80、100、120、150、180 min。冰水浴冷卻至室溫，過膜進(jìn)行色譜分析。如圖4所示，80～120 min產(chǎn)物濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升，120～180 min產(chǎn)物濃度變化率減小。因此，選擇120 min作為DMB最佳衍生化時(shí)間。

圖4 衍生化時(shí)間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of derivatization time

2.2 樣品酸解條件的優(yōu)化

2.2.1 酸解試劑的選擇

對(duì)比0.1 mol/L鹽酸80 ℃酸解1 h和2 mol/L乙酸80 ℃酸解3 h兩個(gè)樣品酸解條件[31-32]，結(jié)果（圖5）表明0.1 mol/L鹽酸酸解耗時(shí)短且酸解更完全，故選擇0.1 mol/L鹽酸作為酸解試劑。

圖5 酸解試劑的選擇Fig.5 Selection of the optimal acid hydrolysis reagent

2.2.2 超聲輔助酸解時(shí)間的優(yōu)化

樣品依次進(jìn)行勻漿凍干、脫乙酰并加入酸解試劑，在功率為180 W的超聲輔助下，80 ℃分別酸解10、20、30、40、50 min，冰水浴至室溫后13 000 r/min離心10 min。取100 μL上清液按1.3.2節(jié)進(jìn)行衍生化并進(jìn)行色譜分析。結(jié)果（圖6）表明在10～30 min的超聲時(shí)間內(nèi)，Neu5Ac和Neu5Gc的峰面積逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間到達(dá)30 min后，峰面積趨于平穩(wěn)，無明顯增加。同時(shí)，超聲30 min已基本達(dá)到常規(guī)水浴1 h的酸解效果，故選用30 min作為超聲輔助酸解時(shí)間。

圖6 超聲輔助酸解時(shí)間的優(yōu)化Fig.6 Optimization of ultrasound-assisted acidification time

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別逐級(jí)稀釋到0.1、0.5、1、5、10 μg/mL。按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行衍生化，以3 次峰面積的平均值作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)曲線y=335.20x+12.275，R2=0.999 9；Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)曲線y=283.28x+1.042 9，R2=0.999 7。Neu5Ac和Neu5Gc在0.1～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液繼續(xù)進(jìn)行倍數(shù)稀釋，衍生化并進(jìn)行測(cè)定，直至被測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)信噪比為3。Neu5Ac和Neu5Gc檢出限分別為0.003 μg/mL和0.01 μg/mL。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行衍生，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。Neu5Ac和Neu5Gc兩種物質(zhì)的RSD分別為1.4%和1.2%，該方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取一定體積的Neu5Ac和Neu5Gc儲(chǔ)備液稀釋至0.1、1 μg/mL和10 μg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度配制3 個(gè)樣本。如表1所示，Neu5Ac和Neu5Gc峰面積的RSD在0.7%～1.8%范圍內(nèi)，該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n＝3）Table 1 Repeatability of the method (n= 3)

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

同一份1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生后分別于第0、1、2、3、4、6、8小時(shí)測(cè)定Neu5Ac和Neu5Gc的峰面積，結(jié)果表明，Neu5Ac和Neu5Gc在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取3 份紅肉，分別加入一定量高、中、低3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定Neu5Ac和Neu5Gc總量，回收率見表2。Neu5Ac和Neu5Gc回收率分別在104.7%～119.7%和91.2%～95.8%范圍內(nèi)，表明樣品處理過程中待測(cè)物質(zhì)具有較少損失，該方法回收率良好。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 Recoveries of Neu5Ac and Neu5Gc from spiked samples

2.4 紅肉及其加工肉中的Neu5Gc和Neu5Ac含量測(cè)定結(jié)果

按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行處理后進(jìn)行檢測(cè)，樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖7，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果表明，不同紅肉中的Neu5Gc和Neu5Ac含量存在差異，見表3。其中，加工肉（火腿）中的結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量均最高，分別為（11.23f 2.73）mg/kg和（71.29f 3.32）mg/kg。生鮮紅肉中羊肉的Neu5Ac含量最高，為（51.38f 10.38）mg/kg。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[13,32]，相關(guān)差異可能源于紅肉部位、來源等方面的不同。

圖7 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.7 Chromatograms of mixed standards and samples

表3 紅肉及加工肉中Neu5Gc和Neu5Ac的含量Table 3 Contents of Neu5Gc and Neu5Ac in red meat and processed meat products mg/kg

3 結(jié) 論

本研究利用單因素試驗(yàn)對(duì)DMB試劑濃度、用量和衍生化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并借助超聲輔助方法對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種耗時(shí)短、效率高的HPLC-FLD方法。較常規(guī)水浴、超聲輔助的方法顯著縮短了樣品前處理時(shí)間，從而提高了檢測(cè)效率。本方法Neu5Ac和Neu5Gc檢出限分別為0.003 mg/kg和0.01 mg/kg，可滿足含有較低唾液酸含量的樣品檢測(cè)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定了紅肉及加工肉中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)Neu5Ac和Neu5Gc的含量，對(duì)更好地理解紅肉中Neu5Gc和癌癥之間的關(guān)系及日常飲食攝入紅肉的種類選擇和攝入量具有一定的參考價(jià)值。