基于核酸適配體傳感器快速檢測(cè)雞蛋中氟蟲(chóng)腈

程 慧，馮 灝，李詩(shī)瑤，劉 順，周陶鴻，彭青枝

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070；2.荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州 434000）

氟蟲(chóng)腈是1989年由法國(guó)羅納普朗克公司生產(chǎn)的苯基吡唑類(lèi)廣譜類(lèi)殺蟲(chóng)劑，因其可通過(guò)胃毒作用抵御害蟲(chóng)的抗藥性，我國(guó)于1994年開(kāi)始引入使用。現(xiàn)代毒理學(xué)研究表明，氟蟲(chóng)腈對(duì)害蟲(chóng)的神經(jīng)膜氯離子通道有強(qiáng)烈的阻礙作用，因其屬于內(nèi)吸性農(nóng)藥，在動(dòng)物性及植物性農(nóng)產(chǎn)品中殘留量日益得到關(guān)注[1-3]。食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的殘留可能會(huì)引起人體器官不同程度的損傷，國(guó)際食品法及我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定氟蟲(chóng)腈在蛋類(lèi)中限量為0.02 mg/kg，并且我國(guó)于2009年開(kāi)始禁用氟蟲(chóng)腈。近年來(lái)氟蟲(chóng)腈再次得到關(guān)注，主要源于歐洲地區(qū)發(fā)現(xiàn)了被氟蟲(chóng)腈污染的雞蛋，經(jīng)過(guò)相關(guān)部門(mén)調(diào)查表明目前市場(chǎng)上所用消毒液中可能含有氟蟲(chóng)腈，養(yǎng)雞場(chǎng)使用混有氟蟲(chóng)腈的消毒液后進(jìn)而間接引起雞蛋污染[4-6]。在“毒雞蛋”事件之前，我國(guó)對(duì)于雞蛋的污染物檢測(cè)項(xiàng)目中未規(guī)定氟蟲(chóng)腈的檢測(cè)方法及最大殘留限量，但這并不表示我國(guó)生產(chǎn)的雞蛋不存在氟蟲(chóng)腈的污染[7-9]。

市場(chǎng)監(jiān)管總局在2019年12月發(fā)布了關(guān)于公開(kāi)征集23 項(xiàng)食品快速檢測(cè)方法的公告，其中13 項(xiàng)明確規(guī)定使用膠體金免疫法，將通過(guò)化學(xué)方法合成羧基修飾的目標(biāo)分子與牛血清白蛋白鍵合成免疫原，膠體金免疫法的技術(shù)核心是合成羧基修飾的目標(biāo)分子，即實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子與羧基的連接。然而以小分子為模板形成的半抗原篩選抗體存在不確定性，每一次進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出的抗體特異性存在差異，以此為基礎(chǔ)建立的膠體金免疫法快速檢測(cè)目標(biāo)分子的不確定性同時(shí)也會(huì)增加。通過(guò)核酸適配體建立的比色法快速分析食品中小分子污染物是目前現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)研究的重點(diǎn)項(xiàng)目，核酸適配體是體外合成的人工抗體，經(jīng)過(guò)篩選試劑盒的分析得到與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體，建立適配體傳感器放大識(shí)別信號(hào)直接獲得目標(biāo)分子的濃度，通過(guò)對(duì)識(shí)別信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)衍生出電化學(xué)法、熒光法、比色法等適配體傳感器[10-13]。

在核酸適配體傳感器中與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的適配體還有相對(duì)應(yīng)的信號(hào)適配體，信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過(guò)修飾信號(hào)適配體實(shí)現(xiàn)。適配體因合成的特殊性易于標(biāo)記和修飾，連接活性基團(tuán)后結(jié)合納米材料和生物酶是適配體傳感器實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的常用方法，將生物酶催化底物顯色反應(yīng)與適配體結(jié)合實(shí)現(xiàn)比色傳感器非常符合食品中小分子污染物快速檢測(cè)的要求，直接目視比色以快速判定食品中小分子污染物的含量，為食品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析帶來(lái)新的思路[13-16]。生物酶直接標(biāo)記納米材料是有限的，若將生物酶提前聚合再與納米材料結(jié)合所達(dá)到的催化效果將遠(yuǎn)大于直接標(biāo)記，同理在催化反應(yīng)完成后將產(chǎn)物再次富集沉淀，加入終止劑分解與顯色劑顯色，這比直接催化底物顯色更加穩(wěn)定[17-19]。另外將識(shí)別小分子污染物的核酸適配體與納米磁珠結(jié)合，使整個(gè)體系的分離與檢測(cè)更加便利，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大和識(shí)別效應(yīng)的加強(qiáng)[20]。本實(shí)驗(yàn)基于納米磁珠-適配體識(shí)別雞蛋中氟蟲(chóng)腈，利用金納米粒子-聚合酶螯合物連接信號(hào)適配體與識(shí)別基質(zhì)結(jié)合后，因聚合酶螯合物上聚集的脲酶可催化分解尿素，向反應(yīng)體系中加入銅離子生成沉淀，加入銅離子顯色劑后沉淀分解產(chǎn)生紅色配合物，此時(shí)紅色配合物的吸光度大小間接反映了與識(shí)別基質(zhì)結(jié)合的氟蟲(chóng)腈含量大小，通過(guò)2 種納米材料及聚合酶螯合物的信號(hào)放大，使本方法對(duì)于雞蛋中氟蟲(chóng)腈的檢測(cè)限可應(yīng)用于食品中小分子污染物的快速檢測(cè)（圖1）。本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)方法目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道，但是利用聚合酶螯合物實(shí)現(xiàn)食品中小分子污染物快速檢測(cè)分析是近幾年研究信號(hào)放大降低檢測(cè)限的熱點(diǎn)[14]，此檢測(cè)方法的創(chuàng)新之處在于首次將可視化的分光檢測(cè)與酶催化反應(yīng)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)基于核酸適配體的小分子污染物快速檢測(cè)，對(duì)于其他農(nóng)藥或獸藥的檢測(cè)尚在研究探索[18-20]。

圖1 基于互補(bǔ)鏈反應(yīng)及聚合酶螯合物顯色反應(yīng)的比色分析原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of colorimetric analysis based on complementary chain reaction and chromogenic reaction of polymerase chelate

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋樣品 市購(gòu)。

羧基磁珠（粒徑1.0～2.0 mm，10 mg/mL） 美國(guó)C h a r m 生物科技有限公司；4-嗎啡啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、尿素（98%）、6-巰基己醇 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；聚合酶螯合物 上?；蚩萍加邢薰?；氯金酸、五水合硫酸銅、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、鹽酸、胱氨酸、碳酸鉀、銅離子顯色劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚標(biāo)準(zhǔn)品 北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；聚合酶螯合物（EnVisionTM） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)中所用氟蟲(chóng)腈適配體（1）和互補(bǔ)適配體（2）均由上海生工生物工程有限公司提供，根據(jù)以下堿基序列定制合成：（1）5’-S H2-(C H2)6-ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT-3’；（2）5’-NH2-(CH2)6-ACCCCCAACTCCGATTCGTCGGCT-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-100恒溫混勻儀 杭州佑寧儀器有限公司；UV-1901紫外-可見(jiàn)分光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 氟蟲(chóng)腈適配體的篩選

隨機(jī)文庫(kù)的固定：取2 nmol初篩文庫(kù)與6 nmol生物素標(biāo)記序列混合后，在金屬浴中95 ℃水浴10 min，30 ℃振蕩反應(yīng)1 h，直到初始文庫(kù)與生物素標(biāo)記序列互補(bǔ)配對(duì)。進(jìn)一步與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠在30 ℃條件下振蕩反應(yīng)1 h，用50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2和5 mmol/L CaCl2）洗滌3 次，磁分離后除去未結(jié)合部分。正向篩選：取100 μg/kg氟蟲(chóng)腈溶液加入到初篩的隨機(jī)文庫(kù)中，在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)1 h后，于4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，磁分離后得到氟蟲(chóng)腈結(jié)合的適配體上清液。反向篩選：取100 μg/kg氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈硫醚混合液加入到初篩的隨機(jī)文庫(kù)中，在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)1 h后，于4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，磁分離后得到未結(jié)合的適配體，再對(duì)其進(jìn)行正向篩選得到結(jié)合的適配體。分離：將上清液加入2 μL 5 mg/mL糖原、50 μL 3 mol/L醋酸鈉和1 400 μL無(wú)水乙醇，混勻后-20 ℃靜置過(guò)夜，12 000 r/min冷凍離心10 min，棄去上清液，再加入1 mL 70%乙醇溶液復(fù)溶后12 000 r/min冷凍離心10 min，最后用100 μL無(wú)菌ddH2O復(fù)溶待用。以80、60、40 μg/kg和20 μg/kg的氟蟲(chóng)腈溶液重復(fù)對(duì)初篩核酸文庫(kù)進(jìn)行正向篩選、反向篩選[21-24]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系：氟蟲(chóng)腈親和性適配體模板鏈20 μL，20 μg/mL上、下游引物各20 μL，2h EsTaqMaster Mix (Dye) 25 μL，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至100 μL。PCR擴(kuò)增條件為三階段循環(huán)：94 ℃變性330 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸320 s。利用凝膠電泳分離和寡聚核苷酸純化試劑盒純化后進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 信號(hào)適配體探針的制備

首先，將取500 μL已溶解的100 mL 1%氯金酸溶液，加入49.5 mL二級(jí)水，待該溶液加熱至沸騰后邊攪拌邊加入1.25 mL 10 mg/L檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱至沸騰后停止加熱，冷卻至室溫待用。取2.0 mL制備好的金納米粒子，加入0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5后與150 μg聚合酶螯合物攪拌過(guò)夜，離心除去未結(jié)合的物質(zhì)。接著，取3 μg巰基化的互補(bǔ)適配體加入金納米粒子-聚合酶螯合物體系中4 ℃振蕩過(guò)夜，離心分離后加入巰基己醇封閉多余位點(diǎn)；最后得到金納米粒子-聚合酶螯合物-信號(hào)適配體復(fù)合物，4 ℃靜置過(guò)夜保存待用[25-28]。

1.3.3 磁珠與識(shí)別適配體的結(jié)合

識(shí)別氟蟲(chóng)腈的適配體經(jīng)過(guò)氨基修飾可與羧基化磁珠通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合，利用EDC和NHS進(jìn)行酰胺反應(yīng)活化羧基磁珠，之后在其表面共價(jià)結(jié)合識(shí)別適配體制備反應(yīng)基質(zhì)。取4 μL 25 mg/mL羧基功能化磁珠，加入100 μL溶于pH 6.0 MES溶液中的2 mg/mL EDC和1 mg/mL NHS活化磁珠2 h，分離洗滌磁珠，加入10 μg識(shí)別適配體，在恒溫振蕩器中保持4 ℃振蕩過(guò)夜，用pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液反復(fù)洗滌磁珠-適配體復(fù)合物，加入胱氨酸作為封閉劑，再洗滌分離得到復(fù)合物4 ℃保存待用[29-31]。

1.3.4 比色適配體傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

將上述實(shí)驗(yàn)合成的過(guò)量金納米粒子-聚合酶螯合物-信號(hào)適配體與100 μL磁珠-適配體復(fù)合物混合，室溫振蕩2 h，磁分離得到信號(hào)適配體與識(shí)別適配體的結(jié)合物。進(jìn)一步與100 μL不同濃度的氟蟲(chóng)腈溶液和雞蛋提取液在室溫振蕩反應(yīng)30 min，由于識(shí)別適配體與氟蟲(chóng)腈的特異性識(shí)別使金納米粒子-聚合酶螯合物-信號(hào)適配體分離出來(lái)，隨后向分離的探針中加入30 mmol/L尿素和20 mmol/L銅離子混合溶液100 μL，室溫振蕩反應(yīng)10 min離心分離，加入銅離子顯色溶液所得產(chǎn)物用于比色分析，建立吸光度與氟蟲(chóng)腈濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系。

雞蛋樣品前處理：稱(chēng)取3 g打散的雞蛋置于15 mL離心管中，加入2 mL乙酸乙酯，輕微顛倒30余次提?。嵉共荒軇×乙苑廊榛?，4 000 r/min離心5 min，取0.5 mL有機(jī)層溶液空氣吹干，用0.2 mL pH 6.0 Tris-HCl緩沖溶液復(fù)溶渦旋混勻待檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)探針的表征

通過(guò)檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子，由于聚合酶螯合物中富集大量脲酶和抗體，金納米粒子和聚合酶螯合物通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合后形成復(fù)合物，復(fù)合物與信號(hào)適配體的巰基通過(guò)Auü S鍵結(jié)合形成新的信號(hào)探針，實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡及紫外分光光度計(jì)驗(yàn)證復(fù)合物與信號(hào)探針的結(jié)合過(guò)程。如圖2所示，金納米粒子的平均粒徑約為13 nm，連接聚合酶螯合物之后平均粒徑明顯增加，表明金納米粒子與聚合酶螯合物成功結(jié)合。如圖3所示，金納米粒子在波長(zhǎng)500 nm左右有一個(gè)特征吸收峰（曲線(xiàn)a），互補(bǔ)適配體在波長(zhǎng)350 nm處有一個(gè)特征吸收峰（曲線(xiàn)c），信號(hào)探針合成后的紫外表征曲線(xiàn)b在波長(zhǎng)350 nm和500 nm處均有吸收峰，證明信號(hào)探針的制備符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 金納米粒子（A）、互補(bǔ)適配體探針（B）透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy images of gold nanoparticles (A) and complementary aptamer probes (B)

圖3 金納米粒子紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of gold nanoparticles

2.2 磁珠-適配體的表征

圖4 50 mg/kg氟蟲(chóng)腈、空白對(duì)照用于比色分析的紫外-可見(jiàn)吸收光譜曲線(xiàn)Fig.4 UV-visible absorption spectra of flufenitrile at 50 mg/kg and blank control for colorimetric analysis

本方法基于適配體連接納米磁珠進(jìn)行雞蛋中氟蟲(chóng)腈的分析檢測(cè)，通過(guò)氟蟲(chóng)腈核酸適配體引發(fā)雜交鏈反應(yīng)，并進(jìn)一步結(jié)合聚合酶螯合物雙功能化金納米粒子標(biāo)記物制備的納米探針復(fù)合物，用于所得產(chǎn)物溫育反應(yīng)?；诖胖檫B接的核酸適配體與其互補(bǔ)鏈之間的結(jié)合作用，使得金納米探針得以成功捕獲從而形成磁性復(fù)合物。利用該復(fù)合物上定量捕獲的高含量脲酶分子的酶催化生物礦化作用，以及進(jìn)一步溶解釋放礦化富集的銅離子進(jìn)行腙類(lèi)顯色劑(E)-1,2-二苯基-2-(2-(吡啶-2-基)亞肼基)乙酮E配位顯色反應(yīng)，從而可以成功實(shí)現(xiàn)本方法的比色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜法考察本方法發(fā)展的上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略對(duì)靶向分析物氟蟲(chóng)腈的信號(hào)響應(yīng)情況。如圖4所示，當(dāng)將50 mg/kg氟蟲(chóng)腈用于比色反應(yīng)后，所得顯色溶液產(chǎn)物在波長(zhǎng)502 nm處出現(xiàn)了一個(gè)很強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收峰；當(dāng)沒(méi)有將所得磁性復(fù)合物經(jīng)過(guò)稀酸溶解處理時(shí)，所得產(chǎn)物溶液在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的特征吸收。同時(shí)，當(dāng)在構(gòu)建的磁珠平臺(tái)上進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，所得產(chǎn)物經(jīng)顯色處理之后只得到十分微弱的背景信號(hào)。這一結(jié)果充分證明了本磁珠分析平臺(tái)上夾心免疫識(shí)別反應(yīng)的成功進(jìn)行以及該工作設(shè)計(jì)的比色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略的可行性。

2.3 條件優(yōu)化

為了保證金納米粒子-聚合酶螯合物納米標(biāo)記物的最佳酶催化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，實(shí)驗(yàn)首先將不同用量的聚合酶螯合物和過(guò)量適配體互補(bǔ)鏈依次加入到1.5 mL制備好的金納米粒子中進(jìn)行納米標(biāo)記物的制備，然后將制備的幾種不同產(chǎn)物分別用于50 mg/kg氟蟲(chóng)腈在構(gòu)建的磁性分析平臺(tái)上的比色分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。從圖5A可以看出，實(shí)驗(yàn)所得顯色產(chǎn)物的吸光度響應(yīng)值首先隨著聚合酶螯合物用量的增加而增大；當(dāng)適配體互補(bǔ)鏈的用量大于3 μg后，顯色產(chǎn)物的吸光度響應(yīng)開(kāi)始緩慢下降。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因應(yīng)該是：當(dāng)金納米粒子表面負(fù)載的適配體互補(bǔ)鏈量較少時(shí)，不能提供足夠的脲酶以用于分解尿素產(chǎn)生顯色物質(zhì)；但是，由于金納米粒子表面空間的制約，過(guò)量的適配體互補(bǔ)鏈則會(huì)導(dǎo)致制備所得的納米標(biāo)記物上聚合酶螯合物的負(fù)載量減少，從而減弱傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。本實(shí)驗(yàn)以3 μg適配體互補(bǔ)鏈和150 μg聚合酶螯合物作為納米標(biāo)記物制備的最佳用量。

在進(jìn)行互補(bǔ)鏈反應(yīng)時(shí)，充當(dāng)生物識(shí)別的氟蟲(chóng)腈適配體用量和雜交鏈反應(yīng)時(shí)間均為影響反應(yīng)效率的重要因素。實(shí)驗(yàn)首先研究了在不同濃度氟蟲(chóng)腈適配體條件下，50 mg/kg氟蟲(chóng)腈在構(gòu)建的磁珠分析平臺(tái)上的紫外-可見(jiàn)光譜響應(yīng)。如圖5B所示，隨著氟蟲(chóng)腈適配體用量不斷增加，所得顯色產(chǎn)物的吸光度也隨之增加；當(dāng)氟蟲(chóng)腈適配體用量大于10 μg之后，其所得顯色產(chǎn)物吸光度開(kāi)始趨向于一個(gè)穩(wěn)定值。該結(jié)果說(shuō)明，用量為10 μg的氟蟲(chóng)腈適配體足夠識(shí)別磁珠平臺(tái)上捕獲的氟蟲(chóng)腈，以實(shí)現(xiàn)其比色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為此，將10 μg氟蟲(chóng)腈適配體用量用作本工作的最佳實(shí)驗(yàn)條件。同時(shí)，還對(duì)互補(bǔ)鏈反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖5C所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所得顯色產(chǎn)物的吸光度不斷增加；當(dāng)該時(shí)間延長(zhǎng)至50 min之后，吸光度響應(yīng)開(kāi)始趨于穩(wěn)定。這說(shuō)明50 min足以使互補(bǔ)鏈反應(yīng)完全進(jìn)行，從而達(dá)到該方法的最佳信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大。圖5D顯示磁珠復(fù)合物與互補(bǔ)鏈及聚合酶螯合物修飾的金納米粒子和氟蟲(chóng)腈反應(yīng)時(shí)間變化對(duì)信號(hào)響應(yīng)的影響，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)響應(yīng)隨之增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至30 min后信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，這表示適配體與氟蟲(chóng)腈反應(yīng)飽和。因此，選擇30 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖5 各因素對(duì)50 mg/kg氟蟲(chóng)腈紫外-可見(jiàn)吸收響應(yīng)的影響Fig.5 Effects of various factors on the UV-visible absorption response of flufenitrile at 50 mg/kg

2.4 性能分析

在上述最佳條件下，實(shí)驗(yàn)考察不同濃度氟蟲(chóng)腈在制備的磁性傳感平臺(tái)上的紫外-可見(jiàn)吸收光譜響應(yīng)。結(jié)果表明，在0.1 μg/kg～50 mg/kg范圍內(nèi)，其吸光度與氟蟲(chóng)腈含量的對(duì)數(shù)值之間成良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為A=0.582 33+0.010 21lgC，R2=0.998。在3 倍信噪比條件下，計(jì)算得到本方法的檢測(cè)限為0.072 μg/kg。

2.5 特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和可靠性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)比色適配體傳感器的特異性和選擇性，選擇相同類(lèi)型的50 mg/kg溴蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)脲、定蟲(chóng)隆、三氟氯氰菊酯作為交叉反應(yīng)的目標(biāo)物，日常監(jiān)督抽檢過(guò)程中陽(yáng)性樣品中此5 種農(nóng)藥的檢出率較高，且目前用于該5 種農(nóng)藥的快速檢測(cè)方法仍在研究中，故選擇此5 種類(lèi)型農(nóng)藥作為檢驗(yàn)氟蟲(chóng)腈的特異性。實(shí)驗(yàn)分別考察在構(gòu)建的磁珠免疫分析平臺(tái)上交叉反應(yīng)。從圖6可以看出，氟蟲(chóng)腈目標(biāo)分析物在磁珠平臺(tái)上具有十分明顯的吸收光譜響應(yīng)，而溴蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)脲、定蟲(chóng)隆、三氟氯氰菊酯沒(méi)有表現(xiàn)出較空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)更為明顯的信號(hào)響應(yīng)。這一結(jié)果表明，該比色分析方法具有較好的特異性。為進(jìn)一步證明該方法對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的特異性，分別研究氟蟲(chóng)腈的主要代謝物如氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟甲腈在含量為5 mg/kg時(shí)本方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明本檢測(cè)方法與GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》同樣適用于氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈的主要代謝物的檢測(cè)。

圖6 試劑空白和5 種農(nóng)藥在磁珠分析平臺(tái)上的吸收強(qiáng)度響應(yīng)Fig.6 Absorption intensity of reagent blank, bromozoonitrile fluolin and fluozoonitrile at 50 mg/kg on the magnetic bead analysis platform

同時(shí)，本工作還利用發(fā)展的信號(hào)策略考察不同含量氟蟲(chóng)腈在通過(guò)相同實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建的磁珠傳感平臺(tái)上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)氟蟲(chóng)腈含量分別為0.01、0.1 mg/kg和10 mg/kg時(shí)，5 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.6%、4.2%和2.7%。此外，制備的適配體磁珠和金納米粒子標(biāo)記物均于4 ℃條件下保存，2 周之后，將其用于含量為50 mg/kg氟蟲(chóng)腈的分析測(cè)定，仍然可以保持97.5%以上初始信號(hào)響應(yīng)。這些結(jié)果表明，該比色免疫分析方法具有較為滿(mǎn)意的重復(fù)性和穩(wěn)定性。為進(jìn)一步考察該方法的分析可靠性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)還將其用于從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市購(gòu)買(mǎi)的雞蛋進(jìn)行檢測(cè)。按照1.3.4節(jié)方法處理。按照GB 23200.115ü 2018《雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》作為參考方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。氟蟲(chóng)腈加標(biāo)樣品含量分別為5.0、20.0 mg/kg和50.0 mg/kg，通過(guò)本方法、傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫和參考方法對(duì)加標(biāo)前后的含量分別進(jìn)行檢測(cè)。如表1所示，樣品回收率為93.1%～100.6%，3 種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，表明該方法用于雞蛋中氟蟲(chóng)腈的檢測(cè)是可行的，本方法在操作簡(jiǎn)便性和準(zhǔn)確性上均符合市場(chǎng)需求，能夠滿(mǎn)足基層市場(chǎng)對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的基本需求。

表1 本方法與參考方法測(cè)定雞蛋中氟蟲(chóng)腈含量結(jié)果對(duì)比Table 1 Comparison of recoveries and RSD values of fluoronitrile in spiked eggs by this method and conventional methods

2.6 傳感器的假陰性和假陽(yáng)性評(píng)價(jià)

表2 本方法測(cè)定雞蛋加標(biāo)樣品的假陰性率和假陽(yáng)性率Table 2 False negative rates and false positive rates calculated for detection of negative egg samples spiked with various concentrations of fluoronitrile by this method

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的雞蛋陰性樣品中分別加入不同含量氟蟲(chóng)腈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)原食藥總局頒布的《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[32]中快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算假陰性率（假陰性總數(shù)/試驗(yàn)樣品總數(shù)）和假陽(yáng)性率（假陽(yáng)性率總數(shù)/試驗(yàn)樣品總數(shù)），每個(gè)濃度設(shè)置20 組實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性樣品參照GB 2763ü 2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[33]制定（蛋類(lèi)中氟蟲(chóng)腈殘留量≤0.02 mg/kg）。如表2所示，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的雞蛋中氟蟲(chóng)腈快速檢測(cè)方法與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法相比較，得出本檢測(cè)方法的假陰性率和假陽(yáng)性率分別為5%和10%，符合2017年及2019年頒布的KJ系列食品快速檢測(cè)方法技術(shù)要求（≤10%）。

3 結(jié) 論

基于磁珠的互補(bǔ)鏈反應(yīng)、識(shí)別及顯色反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)成功建立一種可用于氟蟲(chóng)腈高靈敏檢測(cè)的比色分析新方法。本檢測(cè)方法基于磁珠構(gòu)建分析平臺(tái)簡(jiǎn)化了相關(guān)操作，從而進(jìn)一步縮短溫育反應(yīng)時(shí)間；引入適配體可提高識(shí)別作用的特異性，為結(jié)合互補(bǔ)鏈反應(yīng)和納米標(biāo)記物的酶致生物礦化作用進(jìn)行分析信號(hào)的放大提供了可能性。基于銅離子的高效富集、方便釋放與快速、可視化的顏色反應(yīng)，進(jìn)行比色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略的構(gòu)建，較好彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中直接利用酶催化顯色反應(yīng)進(jìn)行比色信號(hào)的檢出限偏低。故本方法有望在食品中小分子污染物分析領(lǐng)域發(fā)揮較好的實(shí)用價(jià)值。