高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速篩查胡椒粉中多種農(nóng)藥殘留

朱曉玲，劉 杰，余婷婷,*，張 莉，王會(huì)霞，吳婉琴，曹 琦，張亞珍，楊 總

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070；2.上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200335）

農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中起著不可替代的作用，為糧食、果蔬的增產(chǎn)做出了重大貢獻(xiàn)。然而農(nóng)藥的廣泛使用伴隨著日益嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問(wèn)題，農(nóng)藥濫用對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境等方面造成了嚴(yán)重危害[1]。胡椒粉作為一種特殊農(nóng)產(chǎn)品，是世界上最珍貴和最有價(jià)值的香料之一[2]。主要包括黑胡椒粉和白胡椒粉兩種，其中黑胡椒粉主要是由未成熟的胡椒果實(shí)干燥加工而成，白胡椒粉主要由完全成熟的胡椒果實(shí)去皮制成[3]，既是一種很好的調(diào)味品，又是一種珍貴的藥材。中國(guó)是世界上重要的胡椒生產(chǎn)國(guó)之一，但作為一種小眾農(nóng)作物品種，胡椒在我國(guó)的種植普面積遍較小，且較為分散，膳食消費(fèi)量也不大，多數(shù)農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)缺乏在該類產(chǎn)品上登記農(nóng)藥使用的積極性，從而造成農(nóng)民無(wú)藥可用或亂用藥等問(wèn)題[4]。盡管胡椒粉在我國(guó)的飲食結(jié)構(gòu)中所占比例很小，但農(nóng)藥亂用的現(xiàn)象仍易導(dǎo)致該類產(chǎn)品出現(xiàn)農(nóng)藥殘留量過(guò)高的風(fēng)險(xiǎn)，給人們帶來(lái)健康隱患，同時(shí)使我國(guó)在貿(mào)易出口方面易遭遇貿(mào)易壁壘而造成經(jīng)濟(jì)損失，建立胡椒粉中農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)方法，有利于對(duì)我國(guó)胡椒粉產(chǎn)業(yè)農(nóng)藥殘留情況進(jìn)行摸底，并有效促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的后續(xù)發(fā)展。

目前，對(duì)于農(nóng)藥殘留高通量檢測(cè)，多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-14]以及高分辨質(zhì)譜法[15-18]，低分辨質(zhì)譜由于受分辨率、分析速度和掃描模式的限制，無(wú)法達(dá)到農(nóng)藥殘留高通量篩查檢測(cè)和確證的要求，而高分辨質(zhì)譜憑借其在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等方面的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多地應(yīng)用于農(nóng)殘篩查檢測(cè)領(lǐng)域，但研究對(duì)象多集中于水果[19-20]、蔬菜[21-24]、茶葉[25-27]以及相關(guān)的加工產(chǎn)品等，相應(yīng)的前處理方法也較為成熟，但針對(duì)胡椒粉樣品的相關(guān)檢測(cè)報(bào)道較少，因此，本研究以胡椒粉為對(duì)象，采用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF MS）技術(shù)建立169 種農(nóng)藥的高通量多殘留快速篩查方法，具有高通量、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑胡椒粉、白胡椒粉 市售。

169 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司、農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；乙腈、甲醇（均為HPLC級(jí)） 德國(guó)Merck公司；甲酸、乙酸、甲酸銨（均為HPLC級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗羅里硅土（Florisil）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）美國(guó)Supelco公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm有機(jī)系濾膜天津津騰公司；超純水（電阻率為18.2 MΩg cm，25 ℃）美國(guó)Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜（Dionex Ultimate 3000）-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SCIEX Triple TOF 5600+），配Analyst 1.6工作站、定性軟件PeakView、MasterView、定量軟件MultiQuant和數(shù)據(jù)庫(kù)軟件LibraryView 美國(guó)SCIEX公司；Al l e g r a X-1 5 R 型離心機(jī) 美國(guó)B e c k m a n 公司；均質(zhì)器 德國(guó)IKA公司；Elmasonic P型超聲波清洗器德國(guó)Elma公司；YALBOYS型渦旋混合器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；ME204型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性，選擇甲醇、乙腈或丙酮等溶劑配制質(zhì)量濃度10 μg/mL的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。

分組配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，根據(jù)農(nóng)藥化合物的性質(zhì)以及單標(biāo)儲(chǔ)備液的配制溶劑，選擇性挑選每10～20 種化合物為一組，以甲醇為溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，169 種目標(biāo)物共分為11 組，分別編號(hào)為A～K組，配制的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液中各化合物的質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL。

吸取A～K組各混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用空白基質(zhì)溶液進(jìn)行稀釋，配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）混勻的胡椒粉樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 2%乙酸溶液，渦旋混勻后浸泡30 min，加入15 mL乙腈，渦旋混勻，加入6 g無(wú)水硫酸鎂、1.5 g無(wú)水醋酸鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min。

移取4 m L 樣品提取上清液置于裝有凈化粉末（600 mg硫酸鎂、200 mg Florisil、200 mg C18）的離心管中，混勻，4 000 r/min離心3 min，上清液用水進(jìn)行1∶1稀釋，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待儀器分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱： Accucore a Q C18色譜柱（2.1 mmh 100 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和5 mmol/L甲酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for HPLC

1.3.4 TOF MS工作條件

電噴霧離子源，離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；霧化氣流量：55 L/h；氣簾氣流量：35 L/h；輔助氣流量：55 L/h；正離子模式檢測(cè)，母離子采集通道質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000，高分辨模式，去簇電壓80 V，碰撞能量10 eV。設(shè)置母離子強(qiáng)度大于100 cps時(shí)啟動(dòng)信息依賴型子離子采集，子離子采集通道質(zhì)譜掃描范圍為m/z50～1 000，高靈敏模式，去簇電壓80 V，碰撞能量范圍（35f 15）eV。質(zhì)量校正液為聚丙二醇。質(zhì)量偏差設(shè)置為50 mDa。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)庫(kù)的建立采用LibraryView軟件完成，數(shù)據(jù)的采集和處理采用Analyst、PeakView、MasterView軟件完成。采集的樣品數(shù)據(jù)在PeakView、MasterView軟件中，運(yùn)用建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HPLC-Q-TOF MS采集數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索匹配分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)的保留時(shí)間、精確母離子質(zhì)量數(shù)、二級(jí)質(zhì)譜等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行匹配，并對(duì)陽(yáng)性化合物使用MultiQuant軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

2.1.1 一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)

對(duì)169 種農(nóng)藥化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，獲得目標(biāo)物的保留時(shí)間、母離子、質(zhì)量偏差，以及離子化形式等信息。在LibraryView數(shù)據(jù)庫(kù)軟件中輸入每種農(nóng)藥化合物的名稱、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS號(hào)，建立169 種化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)。169 種化合物的相關(guān)信息見(jiàn)表2。

2.1.2 二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)庫(kù)

設(shè)置TOF MS-IDA-Product Ion采集模式，當(dāng)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值超過(guò)閾值時(shí)，自動(dòng)觸發(fā)在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并疊加二級(jí)碎片譜圖，將采集的二級(jí)圖譜添加至LibraryView數(shù)據(jù)庫(kù)軟件中相應(yīng)的化合物項(xiàng)下，對(duì)于二級(jí)質(zhì)譜采集質(zhì)量較差的化合物單獨(dú)進(jìn)樣，設(shè)置TOF MS-Product Ion方法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)與二級(jí)定向采集，得到質(zhì)量較好的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖，并添加至譜庫(kù)，由此建立169 種目標(biāo)化合物的二級(jí)譜庫(kù)，特征碎片離子信息見(jiàn)表2，可應(yīng)用于樣品采集數(shù)據(jù)的篩查匹配，降低出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的概率，提高定性結(jié)果的可信度。

表2 169 種化合物的CAS號(hào)、分子式、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分組以及相關(guān)的質(zhì)譜信息和方法學(xué)數(shù)據(jù)Table 2 CAS numbers, molecular formulas, grouping of mixed standard solutions and mass spectral parameters and methodological data of 169 compounds

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 樣品提取溶劑優(yōu)化

對(duì)于農(nóng)藥多殘留高通量檢測(cè)，一般選用兼容性較好的溶劑進(jìn)行提取。文獻(xiàn)報(bào)道，乙腈相比其他溶劑具有提取效率更高、對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)、糖分等雜質(zhì)的去除效果更好等優(yōu)點(diǎn)[28]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

同時(shí)，由于本研究基質(zhì)主要為胡椒粉類干燥脫水樣品，為了更有效地檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的真實(shí)狀況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)胡椒粉樣品首先進(jìn)行加水浸泡，以增加樣品的分散性以及樣品中農(nóng)藥目標(biāo)物的提取效率。但由于胡椒粉樣品在浸泡過(guò)程中pH值較高，約為7.8，文獻(xiàn)[29]指出，高pH值環(huán)境易導(dǎo)致部分堿敏感農(nóng)藥發(fā)生降解，水直接浸泡時(shí)，部分目標(biāo)物如甲基硫菌靈、甲苯氟磺胺、氧樂(lè)果等回收率較低。因此，選擇引入2%的乙酸，以對(duì)樣品的pH值起緩沖作用，減少堿敏感目標(biāo)物的損失。不同pH值條件下部分農(nóng)藥目標(biāo)物的響應(yīng)比較見(jiàn)圖1。

圖1 不同pH值條件下部分農(nóng)藥目標(biāo)物的響應(yīng)比較Fig.1 Comparison of response to three selected pesticide compounds under different pH conditions

2.2.2 樣品凈化條件優(yōu)化

2.2.2.1 樣品凈化必要性

圖2 凈化前后目標(biāo)化合物的峰面積變化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Statistical results of percentage change in peak area of target compounds before and after purification

圖3 樣品嘧菌酯（A）和氟菌唑（B）對(duì)比圖譜Fig.3 Comparative chromatograms of azoxystrobin (A) and triflumizole (B) before and after sample purification

香辛料類樣品中含有大量油脂、色素、生物堿等成分，屬于復(fù)雜基質(zhì)[30]，會(huì)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品提取液凈化前后的效果進(jìn)行比較，將加標(biāo)樣品提取液分成兩部分，一部分直接過(guò)濾膜進(jìn)行儀器分析，另一部分采用QuEChERS方法凈化處理后過(guò)膜分析，通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)部分目標(biāo)化合物在凈化前后峰面積響應(yīng)變化較大，對(duì)169 種目標(biāo)化合物的峰面積變化率（面積變化率/%=（凈化后目標(biāo)物峰面積/凈化前目標(biāo)物峰面積-1）h 100）計(jì)算，并對(duì)計(jì)算數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。從圖2可以看出，118 種目標(biāo)物凈化前后峰面積變化不大，變化率為20%以內(nèi)，51 種化合物凈化前后峰面積變化率超過(guò)20%，其中15 種凈化后峰面積響應(yīng)變低，分別為異丙威、丙硫克百威、仲丁靈、醚磺隆等；36 種化合物凈化后峰面積響應(yīng)明顯變高，分別為腈苯唑、氟嗎啉、辛硫磷、抑霉唑、肟菌酯、甲咪唑煙酸等。圖3列出了部分化合物凈化前后的對(duì)比效果圖譜，嘧菌酯、氟菌唑在不凈化條件下基本不出峰。因此，凈化對(duì)樣品處理結(jié)果具有一定的改善，可有效降低部分化合物的檢出限，且對(duì)大多數(shù)化合物沒(méi)有造成較大的損失影響，因此，有必要對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理，同時(shí)可有效避免直接進(jìn)樣可能會(huì)造成的色譜柱和質(zhì)譜系統(tǒng)的污染[28]。

2.2.2.2 凈化吸附劑選擇及用量?jī)?yōu)化

采用QuEChERS方法進(jìn)行樣品凈化，一般QuEChERS方法多采用PSA、C18、GCB、Florisil吸附劑粉末對(duì)樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)成分進(jìn)行吸附，以達(dá)到樣品凈化的目的，但研究表明，各種吸附劑的凈化效果是非選擇性的，在吸附雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)對(duì)部分農(nóng)藥目標(biāo)物產(chǎn)生吸附，影響回收率?？疾? 種吸附劑粉末對(duì)本研究中169 種目標(biāo)物的吸附情況，結(jié)果見(jiàn)表3，共有72 種化合物受到吸附劑不同程度的吸附，未列于表3中的97 種化合物不受吸附劑影響，4 種吸附劑中，GCB對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥目標(biāo)物吸附性較強(qiáng)，PSA、C18和Florisil吸附劑對(duì)少量農(nóng)藥品種具有吸附性，PSA主要吸附甲磺隆、芐嘧磺隆、醚苯磺隆、醚磺隆等磺酰脲類除草劑以及咪唑乙煙酸、甲咪唑煙酸咪唑啉酮類除草劑；C18粉末主要吸附甲基硫菌靈、甲胺磷、敵菌靈、福美雙、氯氟吡氧乙酸等化合物；Florisil主要對(duì)甲基硫菌靈、氟甲喹、甲胺磷、福美雙、噻蟲(chóng)嗪等化合物有吸附。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可選擇PSA、C18和Florisil對(duì)樣品進(jìn)行凈化。胡椒粉主要成分為胡椒堿和揮發(fā)性油，有研究表明，PSA對(duì)胡椒堿和揮發(fā)性油的去除效果并不理想，PSA只能去除少量的油性化合物，如能去除韭菜提取物中約0.3%的脂肪，但不適合含有超過(guò)3%脂肪的白胡椒粉和黑胡椒粉樣品[31]，因此，本研究選擇C18和Florisil吸附劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，在兼顧并確保樣品的凈化效果及各目標(biāo)化合物的回收率的前提下，對(duì)吸附劑的用量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定每4 mL提取液加入C18吸附劑200 mg、Florisil吸附劑200 mg進(jìn)行樣品凈化。

表3 PSA、C18、PCB、Florisil吸附劑對(duì)農(nóng)藥目標(biāo)物的吸附情況Table 3 Adsorption efficiency of pesticide compounds by PSA, C18,PCB and Florisil

2.3 HPLC-Q-TOF MS工作條件的優(yōu)化

2.3.1 HPLC流動(dòng)相組成及洗脫梯度優(yōu)化

比較考察甲醇-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L甲酸銨、乙腈-5 mmol/L甲酸銨3 種流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)化合物的影響。對(duì)3 種流動(dòng)相體系下各農(nóng)藥化合物的峰面積數(shù)據(jù)以及出峰時(shí)間、峰形等信息進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，不同流動(dòng)相體系下，農(nóng)藥目標(biāo)化合物的分離度以及質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度均存在差異，在乙腈流動(dòng)相體系下，各農(nóng)藥目標(biāo)物出峰較早，且出峰時(shí)間段密集，分離度相較于甲醇體系稍差。在質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度方面，部分農(nóng)藥化合物峰面積響應(yīng)比較見(jiàn)圖4，在甲醇-5 mmol/L甲酸銨體系下，各農(nóng)藥目標(biāo)物的響應(yīng)值更高，因此，選擇甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為最終流動(dòng)相體系。

圖4 流動(dòng)相體系對(duì)部分農(nóng)藥化合物的峰面積響應(yīng)影響Fig.4 Effects of different mobile phase systems on peak area responses of selected pesticide compounds

在HPLC流動(dòng)相組成體系確定的情況下，對(duì)流動(dòng)相洗脫梯度條件進(jìn)行優(yōu)化，比較洗脫梯度對(duì)目標(biāo)物的保留及分離情況影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終選擇表1中的流動(dòng)相梯度，得到169 種農(nóng)藥目標(biāo)化合物（15 ng/mL）相應(yīng)的提取離子色譜圖見(jiàn)圖5，各目標(biāo)化合物在3～17 min出峰，色譜峰出峰時(shí)間段分布均勻，流動(dòng)相梯度設(shè)置合理。

圖5 169 種農(nóng)藥目標(biāo)物提取離子色譜圖Fig.5 Ion chromatograms of mixed standard solution of 169 pesticides (15 ng/mL)

2.3.2 TOF MS工作條件優(yōu)化

為了獲得可靠豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究利用儀器的信息依賴采集（information dependent acquisition，IDA）工作模式，建立TOF MS-IDA-Product Ion工作流程，在一次進(jìn)樣采集下，同時(shí)獲得一級(jí)高分辨質(zhì)譜圖和二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖。鑒于農(nóng)藥化合物均為小分子物質(zhì)，因此，設(shè)定TOF MS一級(jí)全掃描質(zhì)量范圍為100～1 000 Da，Product Ion二級(jí)掃描質(zhì)量范圍為50～1 000 Da，IDA閾值設(shè)定為100 cps，當(dāng)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值超過(guò)閾值時(shí)，自動(dòng)觸發(fā)在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并疊加二級(jí)碎片譜圖，同時(shí)開(kāi)啟儀器的動(dòng)態(tài)背景扣除功能，可極大降低本底背景的二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，提高樣品中極低含量目標(biāo)物的MS/MS信號(hào)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是質(zhì)譜檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象[32]。實(shí)驗(yàn)考察黑胡椒粉和白胡椒粉的基質(zhì)效應(yīng)，在純?cè)噭┖突|(zhì)提取液中添加標(biāo)樣，比較目標(biāo)物的信號(hào)峰面積，得到基質(zhì)效應(yīng)（基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)標(biāo)樣的峰面積/試劑標(biāo)樣的峰面積）[33]。結(jié)果顯示，黑胡椒粉和白胡椒粉的基質(zhì)效應(yīng)趨勢(shì)一致，共有131 種化合物基質(zhì)效應(yīng)小于0.85，存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)；12 種化合物基質(zhì)效應(yīng)在0.85～1.15之間，基質(zhì)效應(yīng)較弱；26 種化合物基質(zhì)效應(yīng)大于1.15，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；表明胡椒粉基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)結(jié)果存在較大的影響，因此，采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析，以保證檢測(cè)結(jié)果的定量準(zhǔn)確性。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限

用空白樣品提取液稀釋，制備不同質(zhì)量濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各目標(biāo)化合物在5～100 ng/mL范圍內(nèi)，有136 種化合物線性相關(guān)系數(shù)大于0.95（其中93 種化合物的相關(guān)系數(shù)大于0.99），可進(jìn)行定量分析，另外33 種化合物線性相關(guān)系數(shù)小于0.95，只能進(jìn)行定性分析。

根據(jù)GB/T 27417ü 2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》，方法檢出限主要是指用特定方法可靠地將分析物測(cè)定信號(hào)從特定基質(zhì)背景中識(shí)別或區(qū)分出來(lái)時(shí)分析物的最低濃度或量，確定檢出限的方法較多，包括目視評(píng)價(jià)法、空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、校準(zhǔn)方程評(píng)估法、信噪比法等[34]。本研究采用信噪比法進(jìn)行136 種定量檢測(cè)目標(biāo)化合物的檢出限確定，在基質(zhì)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于定性檢測(cè)的33 種化合物，通過(guò)在空白樣品中添加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平分別隨機(jī)檢測(cè)10 次，記錄檢出結(jié)果的陽(yáng)性率和陰性率，確定陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果具備100%可靠性時(shí)的臨界值作為檢出限，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.5.2 回收率和精密度

采用空白胡椒粉樣品作為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用1.3.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，以及1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)儀器方法進(jìn)行測(cè)定，得到平均回收率為26%～140%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～36.0%。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-Q-TOF農(nóng)藥殘留快速篩查技術(shù)對(duì)市售的16 批次胡椒粉樣品（包含黑胡椒粉和白胡椒粉）中169 種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定。其中10 批次樣品檢出甲霜靈，為殺菌劑；8 批次樣品檢出啶蟲(chóng)脒，為殺蟲(chóng)劑；1 批次樣品檢出莠滅凈，為除草劑；所檢出農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)匹配以及二級(jí)碎片譜庫(kù)匹配，綜合得分均高于90 分，實(shí)際樣品中甲霜靈農(nóng)藥碎片離子譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖鏡像比對(duì)如圖6所示。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)篩查出的農(nóng)藥進(jìn)行定量，所檢樣品中甲霜靈的最高含量為102.2 μg/kg，啶蟲(chóng)脒的最高含量為32.6 μg/kg，莠滅凈含量為22.3 μg/kg?，F(xiàn)行有效的GB 2763ü 2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》以及即將實(shí)施的GB 2763ü 2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中均未對(duì)胡椒中的這3 種農(nóng)藥進(jìn)行最高殘留限量規(guī)定。

圖6 胡椒粉樣品中甲霜靈的碎片離子鏡像信息Fig.6 Relative intensities of fragment ions in mass spectrum of phorate sulfoside in pepper powder

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-Q-TOF MS快速篩查胡椒粉中多種農(nóng)藥殘留的分析方法，建立了169 種農(nóng)藥目標(biāo)化合物的高分辨一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)樣品的前處理?xiàng)l件以及液相色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，本方法將QuEChERS前處理與高分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合，可同時(shí)對(duì)樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性、定量分析，提高檢測(cè)效率，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，適用于胡椒粉中農(nóng)藥殘留高通量篩查確證分析。