四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受性研究

陳小江，左華麗，李 偉，吳建顧

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.上海市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，江蘇 鹽城 224153）

四川華吸鰍 (Sinogastromyzon szechuanensis) 隸屬于平鰭鰍科、華吸鰍屬，分布于長(zhǎng)江上游及其支流，西南丘陵河流中[1]。四川華吸鰍味道鮮美，富含必需氨基酸和不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且具有良好的觀賞價(jià)值[2-3]。人類活動(dòng)導(dǎo)致四川華吸鰍的生境被破壞，種群資源量大為減少[4]。1999 年四川華吸鰍被重慶市政府列入重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象，2011 年納入世界自然保護(hù)聯(lián)盟 (IUCN) 瀕危物種紅色名錄[5]。目前對(duì)四川華吸鰍的研究主要集中在資源調(diào)查[6-7]、形態(tài)測(cè)量[8-10]、麻醉劑選用[5,11]、繁殖發(fā)育[12-13]、線粒體全基因組及系統(tǒng)發(fā)育分析[14]等方面。

鹽度是影響魚類生存和生長(zhǎng)的重要指標(biāo)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可通過(guò)提高鹽度來(lái)治療疾病，但超過(guò)魚類的耐受范圍又會(huì)導(dǎo)致其死亡。目前有關(guān)魚類對(duì)鹽度耐受性研究主要有鯔魚 (Mugil cephalus)[15]、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[16]、大黃魚 (Larimichthys crocea)[17]、孔雀魚 (Poecilia reticulata)[18]、澎澤鯽 (Carassius auratusvar.pengza)[19]、異育銀鯽 (C.auratus gibelio)[20]、麥穗魚 (Pseudorasbora parva)[21]、昆明裂腹魚 (Schizothorax grahami)[22]、黃鱔 (Monopterus albus)[23]、咸?？ɡ佐~ (Chalcalburnus chalcoides aralensis)[24]等，四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受能力尚未見(jiàn)報(bào)道。本文首次研究了四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受性，旨在為該物種保護(hù)及人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2017 年10 月—2018 年11 月，四川華吸鰍采于四川沱江水系內(nèi)江段，活體運(yùn)輸至江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖室，養(yǎng)殖1 年以上，使其完全適應(yīng)人工飼養(yǎng)環(huán)境。2019 年12 月開(kāi)展本次試驗(yàn)，試驗(yàn)用水為曝氣48 h 的自來(lái)水，溶解氧質(zhì)量濃度大于8.0 mg·L?1，水溫 (15.5±0.5) ℃，pH (7.6±0.1)。挑選規(guī)格較均勻，體質(zhì)量 (8.495±1.11) g，健康無(wú)病、活力好的四川華吸鰍，試驗(yàn)前停食24 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受性 預(yù)實(shí)驗(yàn)的鹽度梯度按等差數(shù)列1 g·L?1配制6～15 g·L?1的氯化鈉 (NaCl) 溶液，共10 組，每組1 個(gè)3 L 錐形瓶，瓶中放入四川華吸鰍5 尾，充氣并觀察其活動(dòng)狀況，記錄24、48、72 和96 h 的死亡數(shù)。24 h 魚全部死亡的最低鹽度為12 g·L?1，96 h 魚全部存活的最高鹽度為7 g·L?1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照等對(duì)數(shù)間距設(shè)置鹽度組8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22、12 g·L?1，每組3 個(gè)平行，每個(gè)平行 (3 L 錐形瓶) 10 尾，氣泵充氣補(bǔ)氧。觀察四川華吸鰍行為活動(dòng)狀況，準(zhǔn)確記錄24、48、72 和96 h的死亡數(shù)并及時(shí)撈出死魚，利用線性回歸法計(jì)算半致死濃度(LC50)，并計(jì)算安全濃度。

1.2.2 鹽度脅迫對(duì)四川華吸鰍呼吸頻率的影響各試驗(yàn)組鹽度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22、12 g·L?1，待四川華吸鰍安定后啟動(dòng)試驗(yàn)，為期4 h。在試驗(yàn)開(kāi)始與結(jié)束時(shí)，分別在每個(gè)組隨機(jī)選擇四川華吸鰍3 尾，記錄每分鐘呼吸次數(shù)。

1.2.3 鹽度脅迫對(duì)四川華吸鰍窒息點(diǎn)的影響 依據(jù)96 h 全部存活時(shí)的最高鹽度7 g·L?1，設(shè)置鹽度0、1、2、3、4、5、6、7 g·L?1組，每組3 個(gè)平行，每個(gè)平行 (1 000 mL 錐形瓶) 內(nèi)放入四川華吸鰍6 尾，試驗(yàn)期內(nèi)不喂食。第一組充分曝氣4 h 后停止曝氣，用保鮮膜密封，有50%失去平衡、昏迷或?yàn)l死，立即取水樣，采用GB 7489—87 測(cè)溶解氧，即為窒息點(diǎn)。第二組充分曝氣96 h 后停止曝氣，其余步驟同第一組，測(cè)其窒息點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

安全濃度計(jì)算公式[25]：

所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 處理，利用SPSS 19.0進(jìn)行單因子方差分析 (One-way ANOVA)，組間差異采用Duncan's 多重比較，當(dāng)P<0.05 時(shí)差異顯著，統(tǒng)計(jì)值采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 ()”表示。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對(duì)四川華吸鰍的毒性

四川華吸鰍在鹽度梯度8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22 和12 g·L?1各組24、48、72 和96 h的死亡率見(jiàn)表1，利用累計(jì)死亡率和鹽度作線性回歸，各時(shí)間點(diǎn)的 LC50見(jiàn)表2。四川華吸鰍24、48、72 和96 h 的LC50分別為10.50、10.15、9.83和9.46 g·L?1，安全濃度為2.32 g·L?1。

表1 不同鹽度下四川華吸鰍的死亡率Table 1 Mortality of S.szechuanensis at different salinity levels

2.2 鹽度脅迫下四川華吸鰍的呼吸頻率

0 h 組和4 h 組，四川華吸鰍的呼吸頻率均隨鹽度升高而增加 (圖1)。0 h 組，鹽度為4 g·L?1時(shí)的呼吸頻率[(177±10.42) 次·min?1]顯著高于0 g·L?1組[(156.33±10.97) 次·min?1](P<0.05)；4 h 組，鹽度為2 g·L?1時(shí)的呼吸頻率[(150.0± 5.57)次·min?1]顯著高于0 g·L?1組[(135.33±8.39)次·min?1](P<0.05)。鹽度介于0～7 g·L?1時(shí)，4 h 組的呼吸頻率顯著低于0 h 組 (P<0.05)，鹽度介于8.56～12 g·L?1時(shí)，4 h 組的呼吸頻率顯著高于0 h組 (P<0.05)。

表2 鹽度對(duì)四川華吸鰍不同時(shí)間的半致死濃度Table 2 Lethal concentration of salinity to S.szechuanensis at different time

圖1 鹽度對(duì)四川華吸鰍呼吸頻率的影響同一指標(biāo)中，有1 個(gè)字母相同則組間無(wú)顯著差異 (P>0.05)，反之則有顯著差異 (P<0.05)，水溫為 (15.5±0.5) ℃，后圖同此Figure 1 Effect of salinity on respiration frequency of S.szechuanensisValues with the same and different letters for the same index indicate insignificant (P>0.05) and significante difference (P<0.05),respectively;water temperature was (15.5±0.5) ℃.The same case in the following figure.

2.3 鹽度脅迫下四川華吸鰍的窒息點(diǎn)

四川華吸鰍在0～7 g·L?1各鹽度組96 h 的窒息點(diǎn)均顯著低于4 h 后的窒息點(diǎn) (P<0.05，圖2)。4 h組，鹽度為2 g·L?1時(shí)窒息點(diǎn)最低[(0.81±0.02)mg·L?1]，鹽度為7 g·L?1時(shí)窒息點(diǎn)最高[(1.04±0.09)mg·L?1]，顯著高于2 g·L?1組 (P<0.05)。96 h 組，四川華吸鰍的窒息點(diǎn)隨鹽度增加而升高，窒息點(diǎn)最低值出現(xiàn)在0 g·L?1組和1 g·L?1組[(0.60±0.1)mg·L?1]，最高值出現(xiàn)在7 g·L?1組[(0.88±0.09)mg·L?1]，鹽度3 g·L?1以上，四川華吸鰍的窒息點(diǎn)顯著高于0 g·L?1和1 g·L?1組 (P<0.05)。

圖2 鹽度對(duì)四川華吸鰍窒息點(diǎn)的影響Figure 2 Effect of salinity on suffocation point of S.szechuanensis

3 討論

3.1 四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受力

鹽度常視為阻礙因子，當(dāng)鹽度發(fā)生變化時(shí)，無(wú)論高滲環(huán)境，還是低滲環(huán)境，魚類均會(huì)改變其代謝途徑，耗費(fèi)大部分能量用于滲透和離子調(diào)節(jié)，而離子的進(jìn)出主要依賴鰓絲泌氯細(xì)胞[26]。當(dāng)鹽度的變化幅度超過(guò)魚類耐受范圍時(shí)，其血液生化指標(biāo)[27]、非特異性水解免疫酶、非特異性抗氧化免疫酶和各類消化酶的活性均會(huì)受到嚴(yán)重影響，甚至引起死亡[28]。不同種類的魚、同種類不同規(guī)格的魚的滲透能力不同，這取決于先天進(jìn)化及后天馴化[24]。

鹽度對(duì)四川華吸鰍和其他幾種魚類的半致死濃度，隨時(shí)間的增加而降低 (表3)，說(shuō)明對(duì)鹽度的耐受力隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱。安全濃度從大到小排列順序?yàn)椋合毯？ɡ佐~ (成魚)、黃鱔、黑龍江泥鰍 (Misgurnus mohoity dybowsky)、大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)、咸?？ɡ佐~ (幼魚)、達(dá)里湖高原鰍 (Triplophysa dalaica)、麥穗魚、四川華吸鰍、昆明裂腹魚、鰱 (幼魚)、彭澤鯽(幼魚)。鹽度對(duì)四川華吸鰍24、48、72 和96 h的LC50分別為10.50、10.15、9.83 和9.46 g·L?1，安全濃度為2.32 g·L?1，與其他魚類 (成魚) 相比僅高于昆明裂腹魚。地球上淡水含鹽的質(zhì)量濃度為0.01～0.5 g·L?1、海水含鹽的質(zhì)量濃度為16～47 g·L?1(一般35 g·L?1)，表明四川華吸鰍雖不能適應(yīng)海水養(yǎng)殖，但能適應(yīng)所有淡水，可承受較低鹽度的水環(huán)境。在安全濃度范圍內(nèi)，適宜鹽度能降低淡水魚類疾病危害，提高運(yùn)輸、馴化、養(yǎng)殖和育苗成活率等，這對(duì)開(kāi)展四川華吸鰍保護(hù)工作具有十分重要的意義。

表3 四川華吸鰍和部分魚類對(duì)鹽度耐受性比較Table 3 Comparison of salinity tolerance between S.szechuanensis and some fish

3.2 鹽度脅迫對(duì)四川華吸鰍呼吸頻率的影響

魚類呼吸系統(tǒng)的變化可反映身體機(jī)能的變化，魚類對(duì)水環(huán)境中某種因子的改變是否敏感，可通過(guò)呼吸頻率這一指標(biāo)進(jìn)行初步判斷。汪紅軍等[30]用斑馬魚 (Brachydanio rerio) 的呼吸參數(shù)成功監(jiān)測(cè)水體的重金屬離子如汞 (Hg2+)、銅 (Cu2+)、鋅 (Zn2+) 等。Cairns 等[31]通過(guò)測(cè)定呼吸頻率來(lái)監(jiān)測(cè)鋅對(duì)硬頭鱒(Salmo gairdneri) 的安全濃度，發(fā)現(xiàn)未受影響的硬頭鱒呼吸頻率正常，受影響的硬頭鱒呼吸頻率明顯改變[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，四川華吸鰍的呼吸頻率隨鹽度升高而增加。0 h 組，鹽度為4 g·L?1時(shí)的呼吸頻率達(dá)到 (177±10.42) 次·min?1，顯著高于鹽度為0 g·L?1的呼吸頻率[(156.3±10.97) 次·min?1，P<0.05]，鹽度12 g·L?1時(shí)呼吸頻率最高，達(dá) (215.3±7.51)次·min?1，說(shuō)明四川華吸鰍不斷消耗能量來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能，以努力維持體內(nèi)滲透壓平衡。四川華吸鰍在0～7 g·L?1各鹽度組內(nèi)適應(yīng)4 h 后的呼吸頻率較初期 (0 h) 均下降，鹽度等環(huán)境因子的改變會(huì)引起魚類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并在低濃度范圍適應(yīng)一段時(shí)間后恢復(fù)[32]。4 h 組，鹽度為2 g·L?1時(shí)的呼吸頻率為 (150.0±5.57) 次·min?1，顯著高于0 g·L?1組(P<0.05)；相比0 h 組，窒息點(diǎn)最低時(shí)對(duì)應(yīng)的鹽度由4 g·L?1降到2 g·L?1，表明在低鹽度范圍內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，魚的耐受能力降低[22]。經(jīng)過(guò)劇烈的鹽度變化，魚體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，若超出抗氧化系統(tǒng)清除能力或未及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激損傷[33]。四川華吸鰍在8～12 g·L?1各鹽度組，4 h 組的呼吸頻率比初期 (0 h) 明顯增加，表明高滲透壓環(huán)境對(duì)四川華吸鰍造成傷害，需消耗大量能量來(lái)調(diào)節(jié)，因此呼吸頻率異常增大，結(jié)果導(dǎo)致危及生命，這一點(diǎn)與耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，死亡率與鹽度及作用時(shí)間成正相關(guān)。四川華吸鰍在鹽度大于7 g·L?1適應(yīng)4 h，其呼吸頻率超過(guò) (163.3±7.77) 次·min?1，表明機(jī)體已受到嚴(yán)重影響。若利用呼吸頻率來(lái)監(jiān)測(cè)鹽度對(duì)四川華吸鰍的安全濃度，建議臨界值為(150.0±5.57) 次·min?1。呼吸頻率作為代謝的外在表現(xiàn)，而內(nèi)在的生理生化指標(biāo)變化情況有待進(jìn)一步研究。

3.3 鹽度對(duì)四川華吸鰍窒息點(diǎn)的影響

魚類窒息點(diǎn)可作為判斷魚類對(duì)低氧耐受性的重要參數(shù)，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)有重要意義。四川華吸鰍在自然狀態(tài)下，生活于溪流、吸附于巖石，對(duì)水環(huán)境溶氧需求較高。四川華吸鰍的窒息點(diǎn)與鯔、青魚(Mylopharyngodon piceus)、白甲魚 (Onychostoma sima)、厚頜魴 (Megalobrama pellegrini)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco) 接近，遠(yuǎn)高于一般的淡水魚類如翹嘴鲌 (Erythroculter ilishaeformis)、中華倒刺鲃 (Spinibarbus sinensis)、鯉 (Cyprinus carpio)、鰱、草魚 (Ctenopharyngodon idellus)、鳙 (Aristichthys nobilis)、鯽 (Carassius auratus) 等，相比真鯛 (Pagrosomus major) 等海水魚類窒息點(diǎn)低很多(表4)。

表4 四川華吸鰍與幾種魚類窒息點(diǎn)比較Table 4 Comparison of suffocation points between S.szechuanensis and other fish

水生動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)代謝消耗的能量，用于組織的修復(fù)和更新，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[34]。本實(shí)驗(yàn)中，在0～7 g·L?1鹽度脅迫下，適應(yīng)4 h 后，2 g·L?1鹽度組窒息點(diǎn)最低[(0.81± 0.02) mg·L?1]，這與尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus)[35]、禾花鯉 (Procypris merus)[34]、鯔[15]結(jié)果中的趨勢(shì)相似。在0～7 g·L?1鹽度脅迫下，適應(yīng)96 h 后，各鹽度組四川華吸鰍的窒息點(diǎn)均較4 h 下降，0～1 g·L?1窒息點(diǎn)最低[(0.60±0.06) mg· L?1]，這主要由持續(xù)饑餓導(dǎo)致代謝水平下降所致。短時(shí)間內(nèi)適宜的鹽度可降低四川華吸鰍的窒息點(diǎn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，窒息點(diǎn)進(jìn)一步下降，但鹽度大于3 g·L?1各組的窒息點(diǎn)，顯著高于0 g·L?1組和1 g·L?1組 (P<0.05)。

4 結(jié)論

研究四川華吸鰍對(duì)鹽度的耐受性有利于開(kāi)展資源保護(hù)，提高活體運(yùn)輸和暫養(yǎng)過(guò)程中成活率。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鹽度對(duì)四川華吸鰍24、48、72、96 h的半致死濃度分別為10.50、10.15、9.83 和9.46 g·L?1，安全濃度為2.32 g·L?1。以呼吸頻率監(jiān)測(cè)四川華吸鰍對(duì)鹽度的安全濃度，實(shí)驗(yàn)初 (0 h) 為4 g·L?1，呼吸頻率 (177±10.42) 次·min?1；適應(yīng)4 h后為2 g·L?1，呼吸頻率 (150.0±5.57) 次·min?1。此鹽度與半致死濃度推算的安全濃度2.32 g·L?1相近，建議以適應(yīng)4 h 后的呼吸頻率不超過(guò) (150.0±5.57) 次·min?1為參考，粗略監(jiān)測(cè)鹽度對(duì)四川華吸鰍的安全濃度。四川華吸鰍在0～7 g·L?1鹽度脅迫下，適應(yīng)96 h 后窒息點(diǎn)均下降，0～1 g·L?1時(shí)，窒息點(diǎn)最低 [(0.60±0.06) mg·L?1]。建議運(yùn)輸中鹽度控制在0～1 g·L?1，饑餓馴化有助于增強(qiáng)四川華吸鰍的耐低氧能力，提高成活率；鑒于其窒息點(diǎn)相比一般淡水魚類高，養(yǎng)殖、運(yùn)輸中應(yīng)保證充足的溶解氧。鹽度脅迫下四川華吸鰍的生理生化指標(biāo)變化及應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制機(jī)理有待進(jìn)一步研究。