瓦氏黃顙魚(yú)頭腎組織學(xué)觀察與先天性免疫屏障研究

陳 杰，賀 揚(yáng), ，戴旭平，王 均, ，覃川杰,，李 銳

（1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000；2.內(nèi)江師范學(xué)院長(zhǎng)江上游魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 內(nèi)江 641000）

免疫系統(tǒng)是一個(gè)保護(hù)機(jī)體免受感染或疾病的復(fù)雜系統(tǒng)，包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。機(jī)體通過(guò)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)識(shí)別抗原結(jié)構(gòu)，觸發(fā)不同的分子和細(xì)胞機(jī)制以清除抗原。免疫反應(yīng)對(duì)所有個(gè)體都至關(guān)重要，因此在進(jìn)化過(guò)程中除保留所有物種都具有的一些重要特征外，各物種都出現(xiàn)了變化，如免疫反應(yīng)方式、器官、免疫球蛋白以及細(xì)胞因子等。魚(yú)類(lèi)的免疫器官?zèng)]有淋巴結(jié)和骨髓，但具有胸腺、脾臟和頭腎[1]。胸腺、脾臟分別為魚(yú)類(lèi)初級(jí)、次級(jí)免疫器官，頭腎兼具造血、免疫和內(nèi)分泌功能：造血功能類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的骨髓，免疫功能類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的淋巴結(jié)，而內(nèi)分泌功能等同于哺乳動(dòng)物的腎上腺[2-3]。因此，研究魚(yú)類(lèi)頭腎的組成結(jié)構(gòu)對(duì)于深入探索魚(yú)類(lèi)造血、免疫和內(nèi)分泌功能均具有重要意義。

瓦氏黃顙魚(yú) (Pelteobagrus vachelli)，隸屬于鲿科、黃顙魚(yú)屬，主要分布于長(zhǎng)江、黃河、珠江等流域，其生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖周期短、肉質(zhì)鮮嫩，深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者喜愛(ài)[4]。根據(jù)《2019 中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)，2018 年我國(guó)黃顙魚(yú)養(yǎng)殖年產(chǎn)量超50萬(wàn)噸，比2017 年增長(zhǎng)了6.16%[5]。隨著黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及病毒性疾病問(wèn)題日益凸顯，嚴(yán)重威脅到黃顙魚(yú)的健康養(yǎng)殖。增強(qiáng)魚(yú)體免疫力和調(diào)節(jié)免疫體系是預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病的重要策略。因此，掌握魚(yú)體的免疫系統(tǒng)組成、免疫途徑及免疫過(guò)程是研發(fā)魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑和免疫調(diào)節(jié)劑的必備基礎(chǔ)。目前，關(guān)于瓦氏黃顙魚(yú)免疫系統(tǒng)的研究尚薄弱，各免疫器官的組成、結(jié)構(gòu)和分工尚不明確。本研究通過(guò)HE 常規(guī)染色和改良James 特殊染色技術(shù)觀察了頭腎的結(jié)構(gòu)和組成，并采用臺(tái)盼藍(lán)活體染色法對(duì)頭腎的先天性免疫屏障進(jìn)行了定位，以期為瓦氏黃顙魚(yú)疾病的診斷提供新思路，為深入研究頭腎的免疫功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2019 年9 月，于內(nèi)江市水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)瓦氏黃顙魚(yú)50 尾，體質(zhì)量為 (100±20) g，魚(yú)體健康無(wú)病，雌雄均有。活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用2 mg·L?1高錳酸鉀溶液浸泡消毒10 min，移入已備好的曝氣水桶內(nèi)，暫養(yǎng)15 d。每天按瓦氏黃顙魚(yú)體質(zhì)量的3%～4% 投喂飼料 (普加特牌黃顙魚(yú)飼料f3 系列1.5 號(hào)料)，水溫為 (26±2) ℃。每2 d 換水1 次，每次換水1/3。

1.2 頭腎的解剖形態(tài)

隨機(jī)挑選6 尾瓦氏黃顙魚(yú)，用0.5 mL·L?1乙二醇苯醚麻醉致死，放于解剖盤(pán)中。解剖前，將瓦氏黃顙魚(yú)左側(cè)平放；由肛門(mén)前端開(kāi)剪，斜向上剪至側(cè)線(xiàn)下方，然后平行側(cè)線(xiàn)剪至胸鰭基部后端，最后斜向下剪至圍心腔前端，暴露瓦氏黃顙魚(yú)腹腔，觀察頭腎位置、形態(tài)和顏色。

1.3 頭腎的組織學(xué)方法

采集健康瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎，置于4%多聚甲醛中固定48～72 h。固定后經(jīng)50%、70%、80%、95%和100%梯度乙醇脫水，甲苯透明，石蠟包埋。石蠟包埋塊使用LEICA 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行切片，HE 染色切片厚度為3 μm，改良James 染色為7 μm。參照《實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)》[6]及林鴻翔和朱建善[7]的改良James 染色技術(shù)，分別對(duì)2 種切片進(jìn)行HE 染色和改良James 染色。

1.4 先天性免疫屏障觀察

采用臺(tái)盼藍(lán)活體染色法進(jìn)行頭腎先天性免疫屏障觀察。具體方法為：36 尾健康瓦氏黃顙魚(yú)用乙二醇苯醚麻醉后，腹腔注射1% 臺(tái)盼藍(lán)注射液0.2 mL·尾?1。注射后立即放入水中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別于第4、第8、第24、第48 和第72 小時(shí)隨機(jī)采集6 尾瓦氏黃顙魚(yú)，觀察并記錄魚(yú)體顏色變化。于臺(tái)盼藍(lán)注射前，采集6 尾健康瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎，記為第0 小時(shí)，作為對(duì)照。采集的頭腎于4%多聚甲醛中固定，用于組織學(xué)觀察。頭腎經(jīng)脫水、透明、包埋后，進(jìn)行切片。撈取連續(xù)2 張切片，1 張用于HE 染色，1 張直接脫蠟后封片。

1.5 結(jié)果分析與統(tǒng)計(jì)

切片使用Motic SMZ-168 型數(shù)碼顯微鏡在10×和40×物鏡和10×目鏡下觀察，并用Moticam 2506 數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖片。為監(jiān)測(cè)臺(tái)盼藍(lán)的動(dòng)態(tài)變化情況，隨機(jī)拍取 (400×)采集臺(tái)盼藍(lán)處理后的未染色頭腎切片 (每張4 個(gè)視野)，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件定量測(cè)定臺(tái)盼藍(lán)的分布面積。使用SPSS 16.0 軟件One-way ANOVA 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Graph Pad Prism 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 頭腎的解剖位置與形態(tài)

瓦氏黃顙魚(yú)頭腎位于體腔前端的圍心腹腔隔膜的前背方，與胸腔內(nèi)咽退縮肌相連接。頭腎與后腎不相連，顏色與后腎顏色相近，但體積明顯小于后腎。頭腎分為兩葉，對(duì)稱(chēng)地分布于脊柱兩側(cè)，呈扇形，左右兩葉之間有淺凹，紅褐色 (圖1)。

圖1 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎解剖示意圖a.頭腎的解剖位置；b.頭腎的形態(tài)Figure 1 Anatomical diagram of head kidney of P.vachellia.Anatomical location of head kidney;b.Anatomical structure of head kidney

2.2 頭腎的組織結(jié)構(gòu)

健康瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎主要由被膜和實(shí)質(zhì)兩部分組成。被膜位于頭腎最外層，為薄層纖維組織，未見(jiàn)明顯的小梁 (圖2-a)。實(shí)質(zhì)中無(wú)腎單位，可見(jiàn)大量核大、質(zhì)淺的網(wǎng)狀細(xì)胞相互聯(lián)結(jié)，形成形狀不規(guī)則的細(xì)胞支架，與內(nèi)皮細(xì)胞相連，形成網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。根據(jù)淋巴細(xì)胞的聚集程度和排列方式，可將其分為粒細(xì)胞聚集區(qū)和淋巴細(xì)胞聚集區(qū)，兩區(qū)之間無(wú)明顯界限。粒細(xì)胞聚集區(qū)HE 染色較淺，主要為中性粒細(xì)胞和一些淋巴細(xì)胞，細(xì)胞排列無(wú)序，血竇狹窄 (圖2-b)；淋巴細(xì)胞聚集區(qū)呈藍(lán)紫色，淋巴細(xì)胞高度聚集，呈條狀索排列，血竇較寬，相間分布于淋巴細(xì)胞條索間。腎間組織主要位于血管周?chē)?，?xì)胞嗜酸性較強(qiáng)，但嗜堿性較弱，使整個(gè)區(qū)域較淋巴細(xì)胞區(qū)染色淺 (圖2-c)。在淋巴細(xì)胞聚集區(qū)和血管周?chē)梢?jiàn)黃褐色的黑色素巨噬細(xì)胞中心，呈不規(guī)則團(tuán)狀，周?chē)鸁o(wú)扁平細(xì)胞包裹 (圖2-d)。

圖2 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的組織結(jié)構(gòu)HE染色觀察a.被膜 (→)，血竇 (▲)；b.淋巴細(xì)胞聚集區(qū) (○) 與粒細(xì)胞聚集區(qū) (□)；c.腎間組織 (★)；d.內(nèi)皮細(xì)胞 (→)和黑色素巨噬細(xì)胞中心 (▲)Figure 2 HE Staining observation of head kidney of P.vachellia.Capsule (→),blood sinus (▲);b.lymphoid zone (○) and granulocytic zone (□);c.Anterior inter-renal tissue (★);d.Endothelial cells (→) and melanin macrophage centers (▲)

2.3 頭腎的血管與纖維系統(tǒng)

經(jīng)改良James 染色后，觀察瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的血管與纖維分布情況發(fā)現(xiàn)：網(wǎng)狀纖維呈黑色，膠原纖維呈黃色，細(xì)胞核為紅色。頭腎中主要為靜脈血管，可見(jiàn)少量動(dòng)脈血管 (圖3-a)；網(wǎng)狀纖維廣泛分布于頭腎中，而膠原纖維僅見(jiàn)于動(dòng)脈管壁周?chē)?；網(wǎng)狀纖維位于頭腎被膜時(shí)，呈線(xiàn)條狀環(huán)繞頭腎 (圖3-b)；位于靜脈血管時(shí)，繞血管內(nèi)側(cè)數(shù)圈后，呈放射狀向四周分布；位于動(dòng)脈血管時(shí)，貼附于血管管腔(圖3-c)；膠原纖維僅見(jiàn)于動(dòng)脈血管周?chē)?，呈多量膠原纖維圍繞在動(dòng)脈周?chē)?(圖3-d)；除血管和被膜外，還可見(jiàn)單層網(wǎng)狀纖維包繞在黑色素巨噬細(xì)胞中心的外層 (圖3-e)；交錯(cuò)纏繞的網(wǎng)狀纖維形成網(wǎng)眼，分布于腎間細(xì)胞中 (圖3-f)。

2.4 臺(tái)盼藍(lán)活體染色

2.4.1 體色變化 注射臺(tái)盼藍(lán)前，瓦氏黃顙魚(yú)體色呈青黑色 (圖4-a)。腹腔注射臺(tái)盼藍(lán)第4 小時(shí)瓦氏黃顙魚(yú)的胸鰭基部和鰓蓋邊緣被臺(tái)盼藍(lán)浸染為藍(lán)色；第8 小時(shí)吻端、鰓蓋和全身鰭條被浸染為藍(lán)色，鰭條基部最為明顯 (圖4-b)；第24 小時(shí)整個(gè)頭部、各鰭基部及尾柄處呈藍(lán)色(圖4-c)；第48 小時(shí)一些魚(yú)整體呈現(xiàn)藍(lán)色；第72 小時(shí)魚(yú)體藍(lán)色加深 (圖4-d)。

圖4 注射臺(tái)盼藍(lán)不同時(shí)間點(diǎn)瓦氏黃顙魚(yú)體顏色變化a.正常體色，未注射臺(tái)盼藍(lán)；b.注射第24 小時(shí)；c.注射第48 小時(shí)；d.注射第72 小時(shí)Figure 4 Changes of fish color at different time of injection trypan blue in P.vachellia.Normal body color without trypan blue injection;b.24 h after injection;c.48 h after injection;d.72 h after injection

2.4.2 臺(tái)盼藍(lán)的定量分析 腹腔注射臺(tái)盼藍(lán)后，顯微鏡觀察臺(tái)盼藍(lán)的分布情況。結(jié)果顯示，注射后第4 小時(shí)頭腎中出現(xiàn)少量臺(tái)盼藍(lán)，呈點(diǎn)狀或小聚集團(tuán)狀；注射后第8 至第72 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)的數(shù)量逐漸增多，顏色更加分明，細(xì)胞內(nèi)的臺(tái)盼藍(lán)從小聚集團(tuán)慢慢變成大聚集團(tuán) (圖5)。IPP 6.0 測(cè)定臺(tái)盼藍(lán)的出現(xiàn)面積，SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，第0 小時(shí)未檢測(cè)到臺(tái)盼藍(lán)；第4 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)含量較少；第8 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)的數(shù)量有所增加但不顯著 (P>0.05)；第24 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)數(shù)量明顯增多 (0.01

2.4.3 臺(tái)盼藍(lán)分布部位 對(duì)比臺(tái)盼藍(lán)出現(xiàn)比較豐富的第48 和第72 小時(shí)頭腎的HE 染色和不染色切片，發(fā)現(xiàn)臺(tái)盼藍(lán)只出現(xiàn)于血竇內(nèi)壁網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)和血竇中的一些游離的巨噬細(xì)胞內(nèi)，未出現(xiàn)于血管壁、頭腎間組織及黑色素巨噬細(xì)胞中心(圖7)。

3 討論

3.1 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎形態(tài)

頭腎的顏色、大小在一定程度上可反映魚(yú)體的健康狀態(tài)，觀察頭腎形態(tài)顏色，在一定程度上可作為疾病診斷的指標(biāo)。Singh 等[8]發(fā)現(xiàn)慢性氟化物中毒的尖齒胡鯰 (Clarias gariepinus)，頭腎與魚(yú)體的比值明顯減??；Fishelson[9]發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)于嚴(yán)重污染水體中的巨齒天竺鯛(Cheilodipterus lineatus)頭腎明顯增大；何潔[10]報(bào)道尼羅羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus) 感染無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)后，其頭腎顏色變暗并腫大。因此，了解頭腎及其形態(tài)，對(duì)魚(yú)體健康評(píng)價(jià)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。然而，不同魚(yú)類(lèi)的頭腎在形態(tài)上差異較大。有些魚(yú)類(lèi)頭腎和體腎間無(wú)明顯界限，如鮭鱒魚(yú)類(lèi)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 的頭腎呈暗紅色，與體腎無(wú)明顯界限，左右兩葉呈Y 型對(duì)稱(chēng)相連[11-12]；四指馬鲅 (Eleutheronema tetradactylum)、尼羅羅非魚(yú)的腎體前端分叉膨大部分為頭腎，呈深褐色[10,13]；花尾胡椒鯛(Plectorhinchus cinctus)、花鱸 (Lateolabrax japonicus)、駝背鱸 (Chromileptes altivelis)、草魚(yú) (Ctenopharyngodon idellus)、條石鯛 (Oplegnathus fasciatus) 和紅笛鯛 (Lutjanus sanguineus) 的頭腎雖有心腹隔膜與體腎隔開(kāi)，但頭腎基部與腹腔內(nèi)體腎前端相連，且頭腎左右兩葉在基部相連，呈扁平狀，呈暗紅或紅褐色[14-19]；鱖(Siniperca chuatsi) 成魚(yú)頭腎通過(guò)狹窄的過(guò)渡區(qū)與體腎相連[20]。有些魚(yú)類(lèi)頭腎與體腎、兩葉頭腎之間明顯分離，如南方鲇 (Silurus meridionalis)、鯔 (Mugil cephalus) 的頭腎與體腎明顯分離，且頭腎的左右兩葉不相連，顏色為紅褐色[21-22]。也有些魚(yú)類(lèi)頭腎可分為多葉，如鯉 (Cyprinus carpio) 的頭腎分為左右對(duì)稱(chēng)的兩葉，但每一葉又可分為一近三角形和一近四邊形的前后兩小葉，呈褐色[23]。本研究中瓦氏黃顙魚(yú)頭腎與體腎分離，頭腎呈扇形，左右兩葉以淺凹分開(kāi)，與祁保霞[24]觀察的黃顙魚(yú)頭腎與體腎相連、呈圓錐狀的結(jié)果不同。這種差異可能與魚(yú)的體腔大小、體形、生活習(xí)性、生長(zhǎng)環(huán)境等因素相關(guān)[25]。因此，正確認(rèn)識(shí)不同魚(yú)類(lèi)的頭腎形態(tài)和大小，對(duì)魚(yú)體健康狀態(tài)的診斷具有重要意義。

圖5 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎中臺(tái)盼藍(lán)的分布 (未染色)a.第0 小時(shí)未注射臺(tái)盼藍(lán)，正常頭腎；b.第4 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)開(kāi)始出現(xiàn)在一些細(xì)胞里面，呈點(diǎn)狀或小聚集團(tuán)狀 (→)；c.第8 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)開(kāi)始增多(→)；d.第24 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)數(shù)量增多較明顯，可明顯看見(jiàn)小聚集團(tuán)面積增大(→)；e.第48 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)增加特別明顯，可看見(jiàn)大面積臺(tái)盼藍(lán)聚集團(tuán)(→)；f.第72 小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)數(shù)量繼續(xù)增多(→)Figure 5 Distribution of trypan blue in head kidney of P.vachelli (Unstained)a.Trypan blue was not injected at the 0th hour,normal head kidney;b.Trypan blue began to appear in some cells at the 4th hour,showing punctate or small aggregates (→);c.Trypan blue began to increase at the 8th hour (→);d.The number of Trypan blue increased more obviously at the 24th hour,and the area of small aggregates could be clearly seen (→);e.The increase of Trypan blue at the 48th hour was particularly obvious,and large area of Trypan blue aggregates could be seen (→);f.The number of trypan blue continued to increase at the 72nd hour (→).

圖6 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎中第0至第72小時(shí)臺(tái)盼藍(lán)含量變化趨勢(shì)*.0.01

圖7 瓦氏黃顙魚(yú)臺(tái)盼藍(lán)的分布部位a.第48 小時(shí)頭腎，HE 染色，示臺(tái)盼藍(lán)(→)；b.a 中同一區(qū)域頭腎未染色，示臺(tái)盼藍(lán)(→)；c.第72 小時(shí)頭腎，HE 染色，示臺(tái)盼藍(lán)(→)；d.c 中同一區(qū)域頭腎未染色，示臺(tái)盼藍(lán)(→)；e.網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞(→)；f.血竇中游離的巨噬細(xì)胞(→)Figure 7 Distribution of trypan blue in P.vachellia.48th hour head kidney,HE staining,showing trypan blue (→);b.The same area of a,unstained,showing trypan blue (→);c.72nd hour head kidney,HE staining,showing trypan blue (→);d.The same area of c,unstained,showing trypan blue (→);e.Reticular endothelial cells (→);f.Free macrophages in blood sinus (→)

3.2 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的組織結(jié)構(gòu)

被膜是頭腎最外層的保護(hù)層，對(duì)于頭腎的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有很好的保護(hù)作用。疾病狀態(tài)下頭腎的被膜可能出現(xiàn)增厚、變薄、破壞等病變，如尼羅羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌24～72 h，其頭腎被膜覆蓋有白色顆粒狀物質(zhì)[10]。健康頭腎是否有小梁對(duì)于評(píng)價(jià)頭腎增生有重要意義。健康魚(yú)體頭腎的被膜系統(tǒng)差異較大：1) 很薄，如花尾胡椒鯛、花鱸、條石鯛、紅笛鯛、鯉和草魚(yú)，表面僅為一層極薄的纖維結(jié)締組織覆蓋[14-15,17-19,23]，小鋸蓋魚(yú)(Centropomus paralle-lus) 雖然被膜很薄，卻可在實(shí)質(zhì)內(nèi)形成小梁[26]；2) 厚薄不一，如駝背鱸[16]；3) 被膜較厚，如黃顙魚(yú)有較厚的膠原纖維質(zhì)膜包裹[24]。因此，判斷頭腎被膜是否發(fā)生病變，需有健康頭腎作對(duì)照。本研究中，瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎最外層由薄層的結(jié)締組織覆蓋，結(jié)締組織中有網(wǎng)狀纖維，但無(wú)膠原纖維。

硬骨魚(yú)類(lèi)的頭腎在胚胎時(shí)期具有泌尿功能，但隨著年齡的增長(zhǎng)，多數(shù)魚(yú)類(lèi)頭腎的泌尿機(jī)能逐漸喪失，被淋巴髓樣組織充填；僅少數(shù)成魚(yú)的頭腎中仍保留了腎單位，如彈涂魚(yú) (Periophthalmus cantonensis) 的頭腎中有腎單位[25]、尼羅羅非魚(yú)的頭腎中有少量腎小管[26]。本研究中瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎實(shí)質(zhì)中未見(jiàn)腎單位，推測(cè)瓦氏黃顙魚(yú)的頭腎和大多數(shù)硬骨魚(yú)一樣不再有泌尿功能。作為淋巴-腎上腺組織，頭腎除具有大量淋巴細(xì)胞外，還有腎上腺，也可能存在甲狀腺。本研究發(fā)現(xiàn)，瓦氏黃顙魚(yú)有腎上腺，無(wú)甲狀腺。腎上腺的腎間組織細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分界明顯，由網(wǎng)狀纖維分隔成小葉，與南方鲇[21]、條斑星鰈 (Verasper moseri)[27]等相似。

黑色素巨噬細(xì)胞中心被認(rèn)為參與了抗原遞呈、鐵離子回收、異物清除等免疫生理過(guò)程[1,28-29]，其數(shù)量、色素顏色及形態(tài)等可反映魚(yú)體的年齡、應(yīng)激狀態(tài)和疾病狀態(tài)。如黃綠色的脂褐素是過(guò)氧化產(chǎn)物，可能產(chǎn)生自由基，并反映組織分解；棕色或黑色的蠟樣黑色素常見(jiàn)于巨噬細(xì)胞溶酶體中，可能暗示細(xì)菌感染；棕色至黑色顆粒樣的含鐵血黃素可反映紅細(xì)胞破壞[30]。黑色素細(xì)胞中心的形態(tài)、大小以及細(xì)胞成分隨種類(lèi)、器官、性別、季節(jié)的不同而有差異[31]。有些魚(yú)類(lèi)的黑色素巨噬細(xì)胞中心形狀較規(guī)則，周?chē)袉螌颖馄郊?xì)胞包裹，如鯉[23]；有些魚(yú)類(lèi)黑色素巨噬細(xì)胞中心形狀不規(guī)則，如印度囊鰓鯰(Heteropneustes fossilis)[31]。本研究中瓦氏黃顙魚(yú)頭腎中的黑色素巨噬細(xì)胞中心未見(jiàn)單層扁平細(xì)胞包裹，但其邊緣有一層網(wǎng)狀纖維圍繞，推測(cè)瓦氏黃顙魚(yú)頭腎中黑色素巨噬細(xì)胞聚成球體而不散離的狀態(tài)可能是網(wǎng)狀纖維的網(wǎng)羅作用。

3.3 瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的先天性免疫屏障

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)是頭腎的重要組成部分，具有吞噬和抗原遞呈作用[32]。為觀察瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的先天性免疫屏障，本研究使用腹腔注射臺(tái)盼藍(lán)方法對(duì)其進(jìn)行活體染色。臺(tái)盼藍(lán)是一種常用的活體染色劑，可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞是否存活，也可用于機(jī)體的天然屏障觀察[33]。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)腹腔注射后，發(fā)現(xiàn)臺(tái)盼藍(lán)主要分布于瓦氏黃顙魚(yú)頭腎中血竇周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞以及游離的巨噬細(xì)胞，推測(cè)這兩類(lèi)細(xì)胞構(gòu)成了瓦氏黃顙魚(yú)頭腎的先天性免疫屏障。本研究中黑色素巨噬細(xì)胞未見(jiàn)臺(tái)盼藍(lán)存在，是否與黑色素巨噬細(xì)胞的選擇性吞噬有關(guān)有待進(jìn)一步研究。