牡蠣及其酶解產(chǎn)物抗皮膚光老化的初步研究

呂佳桐，林海生, ，秦小明, ，章超樺, ，曹文紅,，高加龍,，鄭慧娜,

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江)/南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088）

近年來(lái)，藥食同源的健康理念越來(lái)越深入人心。人們不僅對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味有要求，而且更注重食品的附加功能，因此功能食品迅速獲得了消費(fèi)者的青睞[1-2]。在美容方面，維A 酸是迄今為止最有效的抗光老藥物[3]，可通過(guò)口服或涂抹使用，但其衍生物可引起肝損害、皮膚脫皮和胎兒畸形[4]，因此茶多酚、膠原蛋白肽、益生菌、蝦青素和微藻葉黃素等[5-7]被加入食品中，制成了多種具有美容功效而又無(wú)副作用的功能食品。藻類多糖、魚類膠原蛋白、貝類多肽具有多種生物活性，且在抗氧化和抗光老化方面效果顯著[8-10]。牡蠣 (Ostreidae) 作為我國(guó)第一大養(yǎng)殖貝類，目前已被證實(shí)具有生殖保健[11]、解酒護(hù)肝[12]、抗光老化[13]等生物活性，且牡蠣中的多肽也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有抗光老化功效[14-15]。UVB (Ultraviolet radiation B)是皮膚光老化的重要影響因素[8,16]，因此多數(shù)研究?jī)H以UVB 照射建立皮膚光老化模型，但近年來(lái)UVA (Ultraviolet radiation A) 愈發(fā)得到研究人員的重視[17]，其穿透力更強(qiáng)，可作用于真皮層，增加基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases,MMPs) 表達(dá)，最終導(dǎo)致膠原降解。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬日光中UVA+UVB 比例，建立UVA+UVB 聯(lián)合照射的小鼠 (Mus musculus) 皮膚光老化模型，從小鼠皮膚的宏觀光老化程度、膠原蛋白和彈性蛋白的分布情況、皮膚的抗氧化能力、皮膚中MMPs 活性、牡蠣的抗炎效果等方面，初步探究了香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis) 及其酶解產(chǎn)物的抗皮膚光老化活性，篩選抗光老化的有效活性成分，為后續(xù)牡蠣活性成分的分離純化和抗光老化作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)7 周齡雌性KM 小鼠 (體質(zhì)量18～22 g)，購(gòu)自廣州迪恩基因技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (魯) 2014-0007，飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃，濕度為50 %～60 %，光周期為12 h 明暗交替，普通維持飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 原料及對(duì)照藥物 香港牡蠣 (購(gòu)自廣東省湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng))；維A 酸片 (山東良福制藥有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 動(dòng)物蛋白酶 (30×104U?g?1，龐博生物工程有限公司)；總超氧化物歧化酶 (TSOD) 測(cè)試盒 (羥胺法)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px) 測(cè)定試劑盒 (比色法)、丙二醛 (MDA) 測(cè)定試劑盒 (TBA 法)、羥脯氨酸 (Hyp) 測(cè)定試劑盒(堿水解法)、Masson 染色液 (南京建成生物工程研究所)；8-羥基脫氧鳥苷 (8-OHDG) 測(cè)試盒、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP-3、MMP-9) 測(cè)試盒 (江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；小鼠白介素6 (IL-6) 測(cè)試盒、小鼠腫瘤壞死因子α (TNF-α) 測(cè)試盒、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β) 測(cè)試盒 (江蘇雨桐生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色液 (南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；醛品紅染色液 (雷根生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

LED 紫外燈 (深圳永霖光電有限公司)；Varioskan Flash 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó)Thermo 公司)；UNIVERSAL 320R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)Hettich 公司)；FE28 型pH 計(jì) (瑞士Mettler Toledo 公司)；DF-101T 集熱氏恒溫加熱磁力攪拌器 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FD-551 大型立式冷凍干燥機(jī) (東京理化器械公司)；DM2000 LED 顯微鏡 (德國(guó)Leica 公司)；JB-L5 石蠟包埋機(jī) (武漢俊杰電子有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 1) 全牡蠣肉粉 (Oyster meat,OM) 的制備。采用新鮮牡蠣肉勻漿后冷凍干燥，其低、中、高劑量組分別命名為OM-L、OM-M、OM-H。2) 牡蠣酶解粉 (Oyster hydrolysis,OH) 的制備。參照李婉[18]的酶解工藝制備。其低、中、高劑量組分別命名為OH-L、OH-M、OH-H。

1.3.2 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成每組10 只，所有小鼠自由飲水飲食，陽(yáng)性對(duì)照組給藥維A 酸，模型組和空白組不灌胃，分組、照射及灌胃劑量見表1。

表1 分組、照射及灌胃劑量Table 1 Grouping,irradiation and intragastric dosage

1.3.3 小鼠皮膚光老化模型的建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，使用脫毛刀將其背部絨毛剃凈，背部裸露面積為3 cm×4 cm，每日剃掉新長(zhǎng)出的絨毛，保持背部皮膚始終暴露。采用LED 紫外燈 [紫外線強(qiáng)度：UVA (365 nm)=360 μW·cm?2和UVB (310 nm)=30 μW·cm?2]每日照射小鼠背部皮膚。正式實(shí)驗(yàn)開始前測(cè)得最小紅斑量為117 mJ·cm?2，即照射5 min。第1 至第2 周照射最小紅斑量的一半 (2.5 min·d?1)，之后每2 周增加30 s，即第3 至第4 周3 min·d?1，第5 至第6 周3.5 min·d?1，第7 至第8 周4 min·d?1，共照射8 周，總照射劑量為4 258.8 mJ·cm?2。

1.3.4 指標(biāo)評(píng)測(cè) 1) 皮膚表征評(píng)價(jià)。皮膚等級(jí)評(píng)分：小鼠二氧化碳(CO2)麻醉處死后，對(duì)其背部皮膚進(jìn)行拍照和皮膚等級(jí)評(píng)分。皮膚皺紋等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的制定參照Kong 等[19]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并加以改進(jìn)(表2)；皮膚總厚度的測(cè)定：皮膚組織經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期UV 照射后，會(huì)產(chǎn)生增生增厚的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為表皮層增厚和皮膚整體厚度增加。剪開小鼠背部皮膚后，在皮膚自然松弛的狀態(tài)下使用電子游標(biāo)卡尺量取單層小鼠皮膚厚度 (mm)。提皮恢復(fù)時(shí)間測(cè)試：小鼠二氧化碳麻醉處死后，用食指和中指輕輕提起小鼠背部中軸線處皮膚，以四肢剛好接觸桌面為準(zhǔn)，松手即開始計(jì)時(shí)，測(cè)量背部皮膚恢復(fù)至提皮前原始狀態(tài)的時(shí)間 (s)[20]。

表2 皮膚皺紋等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Skin wrinkle rating scale

2) HE 染色、Masson 染色及醛品紅染色。組織石蠟包埋：采取小鼠同一處背部皮膚約0.5 cm×0.5 cm，立即浸泡于4%多聚甲醛組織固定液中，常溫固定72 h 后，采用常規(guī)方法脫水，按照皮膚縱向方向石蠟包埋。常規(guī)HE 染色：石蠟切片4 μm，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)。100 倍顯微鏡下觀察切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取3 處測(cè)量皮膚表皮層厚度；Masson 染色：石蠟切片膠原纖維被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，顯微鏡下觀察膠原纖維分布情況；醛品紅染色：彈力纖維被染成紫色，背景呈黃色。顯微鏡下觀察彈性纖維的聚集情況。

3) 生化指標(biāo)測(cè)定。取小鼠0.1 g 皮膚組織剪碎，加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖液，pH 為7.2，使用手持組織研磨器置于冰上充分勻漿，3 600 r?min?1離心20 min，取上清液于4 ℃冷藏待測(cè)。通過(guò)檢測(cè)SOD、GSH-Px、MDA 和8-OHDG 水平評(píng)估皮膚抗氧化能力；通過(guò)檢測(cè)Hyp、MMP-3 和MMP-9 水平評(píng)估皮膚基質(zhì)損傷情況；通過(guò)檢測(cè)IL-6、TGF-β和TNF-α 水平評(píng)估皮膚炎癥程度和自我修復(fù)能力。測(cè)量方法：測(cè)量前預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣品稀釋濃度，最佳稀釋濃度的百分抑制率介于45%～50%，以此作為加樣濃度以獲得最佳線性關(guān)系，減小測(cè)量誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的測(cè)量均參照試劑盒說(shuō)明，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.995，認(rèn)為該次實(shí)驗(yàn)有線性關(guān)系，將吸光值代入公式計(jì)算加樣測(cè)定指標(biāo)的值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示，組間差異用樣本均數(shù)比較的LSD 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)皮膚表征的影響

測(cè)得OM 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為605.2 g·kg?1，OH為603.2 g·kg?1。外源性皮膚老化80%是由紫外線長(zhǎng)期照射引起，主要表現(xiàn)為皮膚松弛、皺紋加深并出現(xiàn)皮革樣的粗糙增厚，此類皮膚衰老也被稱為皮膚光老化[21]。與B 組相比，M 組小鼠的皮膚評(píng)分、提皮恢復(fù)時(shí)間和皮膚總厚度三項(xiàng)指標(biāo)均顯著上升 (P<0.05，表3)，說(shuō)明小鼠光老化皮膚造模成功。與M 組相比，OH-H 組皮膚評(píng)分、提皮恢復(fù)時(shí)間和皮膚總厚度均顯著下降 (P<0.05)；B 和P 組皮膚呈現(xiàn)光滑緊致的狀態(tài)；M 組背部橫向皺紋深且明顯；OM-H、OH-M 和OH-H 組皮膚較光滑，低、中劑量組皮膚出現(xiàn)輕微紅斑，這一現(xiàn)象在高劑量組消失 (圖1-a)。皮膚光老化后皮下血管的狀態(tài)具有雙向性變化，慢性光老化表現(xiàn)為血管萎縮，急性光損傷表現(xiàn)為血管擴(kuò)張和血管通透性增加，導(dǎo)致血管附近炎癥反應(yīng)加劇[22-23]。B 和P 組的血管清晰且分布呈樹枝狀，分支多且血管周圍無(wú)炎癥現(xiàn)象；M 組血管明顯萎縮且血管通透性增加、伴隨炎癥(圖1-b)；隨著OM 的劑量增加，小鼠皮下血管萎縮情況有所改善，但均有明顯的炎癥反應(yīng)；隨著OH 的劑量增加，小鼠皮下血管萎縮情況和炎癥反應(yīng)均有所改善，OH-H 組血管狀態(tài)接近B 組。綜上，OM 和OH 可減輕皮膚光老化產(chǎn)生的皺紋和炎癥，且均在光老化皮膚表征評(píng)價(jià)上表現(xiàn)出劑量依賴性，OM 的中、高劑量組在皮膚評(píng)分和提皮恢復(fù)時(shí)間上、OM 各劑量組的皮膚總厚度以及OH 各劑量組的組間差異均為顯著 (P<0.05)，同劑量下OH 的效果優(yōu)于OM。

表3 皮膚表征評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of skin characterization ±SD

注：每列不同字母代表差異顯著 (P<0.05)Note:Different letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

2.2 皮膚病理染色組織學(xué)分析

2.2.1 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)和表皮層厚度的影響 皮膚長(zhǎng)期經(jīng)受UV 照射會(huì)導(dǎo)致皮膚表皮層增厚[24]，UVA 導(dǎo)致真皮層成纖維細(xì)胞變形和減少[25]。圖2-a 中B 組表皮層結(jié)構(gòu)完整，表皮細(xì)胞排列緊密均勻，真皮組織呈波浪狀，真皮層成纖維細(xì)胞形態(tài)正常；與B 組相比，M 組表皮角化過(guò)度，細(xì)胞增大，真皮層細(xì)胞排列扭曲，細(xì)胞核變形，由于毛細(xì)血管通透性增加，組織間隙可見少量紅細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的光老化癥狀；使用OM 和OH 治療后小鼠真皮層組織的紊亂變形現(xiàn)象減少，有效改善了表皮層角化過(guò)度現(xiàn)象，中高劑量組真皮層纖維細(xì)胞豐富，排列緊密，基本無(wú)變形。表皮層厚度結(jié)果見圖2-b，與B 組相比，M 組表皮層顯著增厚(P<0.05)，小鼠每日攝入180 mg?kg?1的OH 后，表皮層厚度相比M 組顯著下降 (P<0.05)，與B 組無(wú)顯著差異 (P>0.05)。攝入OM 后也具有同樣作用，但中、高劑量的OH 效果優(yōu)于同劑量的OM。結(jié)果表明食用OH 后，真皮層細(xì)胞得到保護(hù)，細(xì)胞變形和凋亡的情況也有所減少，并能夠防止表皮角化過(guò)度。

圖2 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠光老化皮膚結(jié)構(gòu)和表皮層厚度的影響同一指標(biāo)中標(biāo)有不同字母代表差異顯著 (P<0.05)；圖4～圖6 同此Figure 2 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on the structure and thickness of photoaging skin in miceFor the same indicator,different letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 4?Figure 6.

2.2.2 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)膠原纖維和彈力纖維的影響 UVA 會(huì)穿過(guò)表皮層作用于真皮層，導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs) 表達(dá)增加，最高可達(dá)10 倍[26]。MMPs 的不同亞型作用于不同基質(zhì)，幾種MMPs 協(xié)同作用可完全降解皮膚基質(zhì)，導(dǎo)致不可逆的皮膚光老化。目前已知MMP-1作用于Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，可幾乎完全裂解膠原纖維；MMP-3 可以廣泛作用于Ⅳ型膠原纖維、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和板層素膠原纖維；MMP-9可進(jìn)一步降解MMP-1 所產(chǎn)生的膠原蛋白片段，使皮膚不能自主修復(fù)膠原蛋白結(jié)構(gòu)，并使膠原纖維和彈性纖維減少、膠原合成降低、異常彈性纖維增生成束、細(xì)胞外基質(zhì)消失斷裂，最終導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)光老化癥狀[27-28]。M 組的膠原纖維呈現(xiàn)卷曲、排列混亂的狀態(tài)，彈力纖維在表皮層明顯增多、呈現(xiàn)大面積的紫色，且在真皮層聚集扭曲、增粗、分布不均。與M 組相比，OM 和OH 可減少光老化皮膚中的膠原排列卷曲紊亂和彈性纖維聚集增生的現(xiàn)象，隨著劑量的增加，小鼠皮膚中平行有序排列的膠原蛋白增多，膠原卷曲聚集的區(qū)域減少 (圖3-a)；表皮層被染成紫色的彈力纖維的增生程度降低，真皮層的彈力纖維呈網(wǎng)狀分布，聚集成束的區(qū)域減少(圖3-b)。以上結(jié)果表明OM 和OH 可以減輕皮膚中的膠原蛋白流失，降低皮膚表層的過(guò)度角化，保持膠原蛋白和彈性纖維呈網(wǎng)狀均勻分布，避免皮膚松弛。

圖3 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠光老化皮膚中膠原纖維 (a) 和彈力纖維 (b) 的影響 (100×)圖3-a 中黑色箭頭指示混亂卷曲的膠原纖維，黃色箭頭指示排列規(guī)律的膠原纖維；圖3-b 中黑色箭頭指示彈力纖維在表皮層的異常增生Figure 3 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on collagen fibers (a) and elastic fibers (b) in photoaging skin of mice (100×)In Figure 3-a,the black arrows indicate the disorderly and curly collagen fibers,and the yellow arrows indicate the regularly arranged collagen fibers;in Figure 3-b,the black arrows indicate the abnormal proliferation of elastic fibers in the epidermis.

2.3 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)皮膚抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激是皮膚光老化的重要機(jī)制之一，UVB主要作用于表皮層和真皮層淺表，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量自由基 (ROS)，機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶不能夠及時(shí)將其消滅，多余的ROS 會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核苷酸 (DNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)[29]，剝奪蛋白質(zhì)、生物膜、DNA、RNA 等生物大分子的電子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活、細(xì)胞功能病變、DNA 扭曲變形和RNA轉(zhuǎn)錄障礙，對(duì)皮膚產(chǎn)生不可逆?zhèn)?；本研究通過(guò)檢驗(yàn)DNA 的標(biāo)志性氧化產(chǎn)物8-OHDG 和細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 來(lái)衡量皮膚氧化程度。自由基還會(huì)引起調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶AMPK 和核因子NF-κB 等信號(hào)通路異常，進(jìn)而觸發(fā)其他光老化機(jī)制[30-31]。因此，研究皮膚中的幾種關(guān)鍵抗氧化酶的活性以及生物大分子的氧化產(chǎn)物，即可衡量OM和OH 對(duì)皮膚抗氧化能力的影響。小鼠皮膚中的抗氧化酶和氧化產(chǎn)物變化見圖4，與M 組相比，小鼠攝入OM 和OH 后，皮膚中的GSH-Px 表達(dá)量顯著增加，OH-M 和OH-H 組的SOD 活性較M 組顯著增加，MDA 顯著降低 (P<0.05)，但所有劑量組之間在MDA 含量上均無(wú)顯著差異 (P>0.05)。其中OH-H 組在保護(hù)DNA 方面表現(xiàn)優(yōu)異，小鼠皮膚中的8-OHDG 顯著低于M 和B 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)果表明，OM 和OH 能夠顯著提高光老化小鼠皮膚的抗氧化酶活力，保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)和DNA 不受自由基攻擊，從而提升皮膚抑制由ROS 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激能力。

圖4 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷的影響Figure 4 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on SOD,GSH-Px,MDA and 8-OHDG

2.4 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)減輕皮膚基質(zhì)損傷的影響

紫外線導(dǎo)致MMPs 活性增強(qiáng)，MMPs 協(xié)同作用于膠原纖維、彈性纖維和明膠等基質(zhì)，最終導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生皺紋和松弛。本研究中小鼠皮膚在Masson 染色中，OM 和OH 對(duì)皮膚中膠原蛋白和彈性纖維的有序排布產(chǎn)生了積極影響，因此本研究選取MMP-3 和MMP-9 以及膠原蛋白特有的羥脯胺酸 (Hyp) 進(jìn)一步探究OM 和OH 對(duì)保護(hù)皮膚中膠原的作用途徑。與B 組相比，M 組的MMP-3 和MMP-9均增加 (P<0.05)，Hyp 降低 (P<0.05，圖5)。與M 組相比，小鼠攝入中、高劑量的OH 后，MMP-3的表達(dá)顯著降低，攝入中、高劑量的OM 和OH后，MMP-9 的表達(dá)降低 (P<0.05)。在攝入OH 和高劑量的OM 后，皮膚中Hyp 含量與B 組相比無(wú)顯著差異 (P>0.05)。Han 等[32]的研究表明，UVB照射的光老化小鼠服用牡蠣水解物可降低MMPs基因，同時(shí)增加I 型膠原和TIMP-1 基因表達(dá)。因此猜測(cè)對(duì)于UVA+UVB 導(dǎo)致的皮膚光老化，OH 具有相似的作用機(jī)制，OH 通過(guò)抑制MMPs 活性來(lái)減緩膠原蛋白分解，有效保護(hù)了皮膚中的膠原蛋白，結(jié)合小鼠背部皮膚的Masson 染色結(jié)果，猜測(cè)OH 能夠減少皮膚中膠原蛋白的扭曲變形[33]。

圖5 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)MMP-3 (a)、MMP-9 (b)和羥脯胺酸 (c) 的影響Figure 5 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on MMP-3 (a),MMP-9 (b) and Hyp (c)

2.5 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)光老化皮膚組織中炎癥反應(yīng)的影響

紫外線刺激皮膚產(chǎn)生的大量ROS 和TNF-α，可激活MAPK 途徑中的蛋白激酶和磷酸酶，導(dǎo)致c-Jun 和c-Fos 蛋白的表達(dá)增加，最終形成AP-1 和NF-κB，而NF-κB 調(diào)節(jié)許多促炎細(xì)胞因子，具有代表性的則是成纖維細(xì)胞分泌的IL-6，可導(dǎo)致細(xì)胞毛細(xì)血管的通透性增加、中性粒細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)和激活，最終引發(fā)皮膚紅斑等急性炎癥損傷[34]。與TNF-α 相反的是TGF-β 可促進(jìn)前膠原基因轉(zhuǎn)錄，起到抗炎作用[35]。本研究選取IL-6、TNF-α和TGF-β 衡量皮膚炎癥反應(yīng)程度。皮膚光老化小鼠攝入OM 和OH 后，皮膚中的IL-6 水平有所降低，OM-H、OH-M、OH-H 組TNF-α 水平降低 (P<0.05)，代表NF-κB 調(diào)節(jié)炎癥反映途徑受到阻礙，在增強(qiáng)TGF-β 表達(dá)方面，OH-M 組最顯著 (P<0.05)。在攝入高劑量的牡蠣酶解物后，TNF-α 水平顯著低于B 組 (P<0.05，圖6)。結(jié)果表明OM 和OH 可降低皮膚中炎癥因子的表達(dá)，切斷I L-6 激活A(yù)MPK 通路，從而降低MMP-1 的表達(dá)。牡蠣酶解物通過(guò)提高TGF-β 水平提升皮膚的抗炎能力，結(jié)合小鼠皮下組織血管分布圖，和小鼠背部圖中皮膚紅斑的形成程度，發(fā)現(xiàn)OH 通過(guò)降低促炎因子表達(dá)和降低MMPs 表達(dá)2 種途徑實(shí)現(xiàn)抗皮膚光老化的作用。

圖6 牡蠣及其酶解產(chǎn)物對(duì)白介素6、腫瘤壞死因子α (b) 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (c) 的影響Figure 6 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on IL-6 (a),TNF-α (b) and TGF-β (c)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)模擬自然光比例的UVA+UVB 每天照射構(gòu)建小鼠皮膚光老化模型探究牡蠣的抗光老化活性。結(jié)果表明，OM 和OH 能夠使光老化皮膚的皺紋減輕、防止皮膚呈皮革樣增厚、增加皮膚彈性、保護(hù)皮膚中的膠原蛋白的網(wǎng)狀排列、避免彈性纖維在表皮的異常增生，并能夠改善皮下毛細(xì)血管萎縮和通透性增加。參考光老化機(jī)理相關(guān)的研究[36]，總結(jié)OM 和OH 的3 種抗皮膚光老化途徑：1) 顯著提高皮膚中抗氧化酶的活力、保護(hù)皮膚組織中的細(xì)胞膜脂質(zhì)和DNA 不被氧化；2) 抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá) (MMP-3、MMP-9)，保護(hù)真皮膠原蛋白 (Hyp)；3) 高劑量的OH 可顯著降低皮膚中炎癥因子的表達(dá) (IL-6 和TNF-α)，并提高皮膚的抗炎能力 (TGF-β)。OM 和OH 均在抗光老化活性上表現(xiàn)出劑量依賴性，OH 的抗光老化效果更顯著。雖然實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)OH 具有抗光老化活性，但牡蠣主要以藻類為食，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)證實(shí)海藻多糖具有良好的抗氧化活性[37-38]，而ROS 學(xué)說(shuō)作為光老化機(jī)制中的一條重要通路，難免會(huì)將牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中藻類多糖的抗氧化活性與之聯(lián)系起來(lái)。因此，需要對(duì)牡蠣酶解物中的多肽、多糖進(jìn)一步分離純化，進(jìn)行更詳細(xì)的研究。