開放實驗教學 優(yōu)化分子生物學精品實驗項目

桂 馨， 石嘉豪， 汪貴英， 邢麗波， 陸東東

（同濟大學生命科學與技術(shù)學院，上海200092）

0 引 言

分子生物學是從分子水平研究核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其在生命現(xiàn)象中體現(xiàn)的重要性和規(guī)律性的科學，是一門實驗性極強的學科，其理論與實驗方法已經(jīng)滲透到生命科學研究的各個領域［1-3］。分子生物學實驗作為生命科學和醫(yī)學專業(yè)重要的實驗課之一，在我國多數(shù)學校均作為一門必修課程。我院將分子生物學實驗操作作為本科生畢業(yè)技能考核的重要標準之一，多年來分子生物學實驗課時安排為每屆本科生34 學時，共包括6 個實驗項目，項目設計從簡單的驗證性實驗到綜合設計性實驗層層深入［4］。近年來結(jié)合本學科的發(fā)展對實驗項目進行了調(diào)整，設計了“通過報告基因檢測細胞內(nèi)cAMP 水平變化”“哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)染”等實驗項目。其中尤以“報告基因檢測”實驗較為復雜，難度較高，該實驗涉及報告基因載體質(zhì)粒構(gòu)建、細胞報告基因轉(zhuǎn)染、報告基因表達產(chǎn)物鑒定等多個環(huán)節(jié)［5］。特別是本實驗中接觸到多種實驗技能，如細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)、細胞傳代培養(yǎng)技術(shù)、細胞計數(shù)、質(zhì)粒的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)、蛋白濃度測定方法、報告基因的檢測技術(shù)和生物統(tǒng)計學分析等。

然而，由于實驗學時和操作時間的限制，學生要參與所有過程是困難的，所以大部分實驗由教師提前準備，學生僅完成課堂實驗部分內(nèi)容，幾乎達不到整個實驗的50%教學內(nèi)容。為了讓學生能夠得到更多的實驗技能訓練和了解整個實驗的技術(shù)路線，從拓展實驗教學的角度出發(fā)，以“報告基因檢測”實驗為例，讓學生參與到整個實驗過程，從而培養(yǎng)學生的操作技能和研究思維能力［6］。

我院從以下幾方面對實驗教學進行了探索，通過建立精品實驗項目，力求以點帶面將分子生物學實驗打造成實驗“金課”［7］。

1 開放實驗室，讓學生全過程參與實驗操作

鑒于原有的實驗過程受實驗學時的限制，學生只能操作其中的幾個步驟，隨著學校大力提倡在課余時間給本科生開放實驗室，為了讓學生有更多的時間參與到完整的實驗教學過程中，引導學生在課余時間系統(tǒng)掌握實驗課內(nèi)容［8］，利用教學實驗室的開放機制，讓學生利用課余時間進入實驗室，在老師的指導下完成所有的實驗過程［9-10］，增加學生實驗操作的機會，增強學生實驗操作技能，牢固掌握相關的實驗原理。

實驗室開放前，僅對“報告基因的測定和統(tǒng)計分析”實驗規(guī)定由學生操作，其他如細胞培養(yǎng)、細胞計數(shù)、報告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染效率的分析、細胞激活劑處理、報告基因的測定和統(tǒng)計分析等多項實驗環(huán)節(jié)基本都由教師操作，改進后所有實驗環(huán)節(jié)均由學生操作。

學生通過親自參與各個實驗步驟，掌握實驗操作的每個細節(jié)，拓展了學生的操作技能。對于“報告基因檢測”實驗，還進行了如下的改進：① 課堂教學前1周，開始進行教學相關實驗技術(shù)的訓練（建立無菌操作觀念，掌握包括滅菌、細胞傳代培養(yǎng)等）。②課堂教學前兩天，對實驗用的細胞進行計數(shù)及分組（掌握細胞計數(shù)方法及稀釋方法）。③ 課堂教學前1 天，對實驗用的細胞進行報告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染（需耗時6 h）（掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的技術(shù)）。④課堂教學當日清晨，讓學生親自加入激活劑。⑤ 課堂教學課上進行報告基因的測定和統(tǒng)計分析并完成實驗報告。

通過這樣的實驗安排，使學生對實驗室過程有了充分的了解。①原來學生沒有掌握細胞培養(yǎng)技術(shù)，對細胞的狀態(tài)、培養(yǎng)基的使用等沒有感性認識，通過試驗后，學生能正確配制細胞培養(yǎng)液，對細胞生長的健康狀況有了初步的直觀認知和判斷，加深了細胞培養(yǎng)無菌操作的理念理解，熟悉了細胞傳代培養(yǎng)的每個步驟。②原來學生對于報告基因檢測只認為在老師轉(zhuǎn)染好的細胞中加入底物上機檢測就完成實驗了，但是對細胞中報告基因如何進入細胞，如何發(fā)揮作用都不了解。通過改進，學生能夠通過計數(shù)來調(diào)節(jié)細胞濃度然后傳代細胞，能根據(jù)細胞的濃度來調(diào)整質(zhì)粒的用量，并通過熒光顯微鏡判斷分析轉(zhuǎn)染的效率，如何使用激活劑并了解報告基因的處理和數(shù)據(jù)分析方法。對整個實驗過程有了系統(tǒng)性的了解與認識。

2 優(yōu)化實驗，提高實驗準確性

充分利用儀器設備資源，優(yōu)化實驗方法，提高數(shù)據(jù)精確性［11］。依托本院實驗教學中心以及大型儀器公共實驗平臺的設備資源，通過實驗室對本科生開放的機制，讓學生可以自主選擇對實驗前后的拓展實驗。通過使用更新升級的儀器設備（見圖1），嘗試不同試驗數(shù)據(jù)的檢測方法，優(yōu)化實驗方案，全面滲入實驗課程每個細節(jié)。

2.1 檢測蛋白濃度方法改進

原實驗用721 分光光度計通過紫外吸收（OD280 nm波長）法來測定蛋白濃度，現(xiàn)在改用更精確靈敏的BCA法，同時配置了高效快速的多功能酶標儀來測定實驗結(jié)果，使實驗結(jié)果更精準。

2.2 增加通過轉(zhuǎn)染帶熒光標簽的質(zhì)粒判斷轉(zhuǎn)染效率

通過倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況，并通過拍照及軟件分析判斷熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，增加收集一項實驗數(shù)據(jù)，更精確地判斷報告基因的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 改變細胞計數(shù)方法

原有計數(shù)方法是通過血球計數(shù)板人工計數(shù)，耗時較長，通過購置全自動細胞計數(shù)儀，能快速準確地實現(xiàn)細胞計數(shù)，縮短了實驗時間，提高了實驗效率。

圖1 實驗中使用的部分儀器圖

3 優(yōu)化實驗設計，拓展實驗深度和廣度

3.1 調(diào)整實驗中試劑加入量

在每個實驗中，試劑加入量的準確使用是實驗成功的關鍵，所以，調(diào)整實驗中的試劑加入量，作為預實驗要確定的一個重要指標。例如，報告基因檢測實驗中需要用激活劑對細胞進行處理，升高細胞內(nèi)的cAMP水平，不同處理時間會有不同的結(jié)果，通過學生自行設計選擇不同的試劑濃度、處理時間，得到不同的實驗結(jié)果。再根據(jù)實驗結(jié)果找出最合適的激活劑計量，使實驗在計量上更精確。最后通過學生對實驗數(shù)據(jù)的分析處理，得出最佳的處理時間。這樣每組學生的實驗報告數(shù)據(jù)都是不同的，提高了學生對實驗探索的興趣。

3.2 擴充細胞種類

實驗中研究對象的選擇為實驗結(jié)果的分析提供了很好的依據(jù)，因為假如在一種細胞中沒有實驗結(jié)果，可能在另一種細胞中獲得滿意的結(jié)果，從而提高了學生分析實驗結(jié)果的能力。以本實驗為例，從細胞傳代培養(yǎng)開始實驗教師提供幾種不同的腫瘤細胞供學生選擇，除了在實驗講義上使用的293T（人胚腎細胞），增加了CNE（人鼻咽癌細胞）、4T1（小鼠乳腺癌細胞）、A549（人非小細胞肺癌細胞）、Hela（人宮頸癌細胞）等多種腫瘤細胞供學生選擇使用。不同的細胞轉(zhuǎn)染效率不同（見圖2），實驗結(jié)果也不同，這種帶有探索性的實驗過程，雖然以實驗講義中的實驗步驟為主干，卻大大提高了實驗的自由度，也激發(fā)了學生科學探索的欲望，有利于學生掌握相關實驗技術(shù)，加深理解實驗涉及的分子生物學原理。

4 結(jié) 語

在教學過程中實驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，一般要求每個學生對結(jié)果進行處理分析并詳細討論。數(shù)據(jù)越豐富，學生討論得越深入。在本實驗中，由于每組同學使用的細胞和實驗相關試劑及藥物處理時間的不同，每組學生得到的實驗結(jié)果都不盡相同，學生不僅可以就本組的數(shù)據(jù)進行分析，亦可橫向聯(lián)合多組數(shù)據(jù)進行比較、總結(jié)。增加了數(shù)據(jù)總結(jié)環(huán)節(jié)的挑戰(zhàn)性。通過這一過程，促進學生對相關知識點的綜合學習和應用，加深對已掌握的理論知識的理解，全面提高學生的自覺動手能力，拓寬視野，豐富思維，將知識融會貫通，從而得到較全面的科學分析與技能訓練，培養(yǎng)學生科學實驗素質(zhì)和綜合實驗的能力［12-13］。

圖2 不同細胞轉(zhuǎn)染效果熒光顯微鏡圖片

我院分子生物學實驗課程至今已開設16 年，逐漸形成了較穩(wěn)定的主講教師、實驗輔助老師以及助教教學隊伍。實驗條件近年來也得到極大提高，教學方法密切結(jié)合學科特點，受到學生和督導老師的一致好評。

報告基因檢測技術(shù)，是一種間接的測定技術(shù)，涉及報告基因載體質(zhì)粒構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、報告基因產(chǎn)物測定等環(huán)節(jié)。螢光素酶檢測系統(tǒng)是一個先進指示系統(tǒng)［14］，操作簡便，靈敏度高，輝光型信號亮且持久，可用于因靈敏度不夠而受限的挑戰(zhàn)性應用。通過本精品實驗項目將報告基因檢測技術(shù)介紹給學生，有一定的獨創(chuàng)性。通過實驗全面提升學生對于分子生物學基礎知識的理解，訓練學生綜合實驗的能力［15］。

同時由本實驗項目提出實驗相關的問題啟發(fā)學生思考討論，更進一步依托本院教學實驗中心的實驗室空間和設備資源開辟延伸課堂，通過實驗室開放機制，鼓勵學生自主選擇對實驗前后的拓展實驗、試劑準備、實驗操作、儀器設備使用、實驗優(yōu)化等方面介入實驗過程每個細節(jié)，建立該實驗項目的延伸課堂體系。并在實驗教學中引導學生積極思考、訓練其思維能力、動手能力和分析能力。通過實驗報告評估，動手能力評價，實驗重復性好壞，以及問題分析和解決方案的擬定等多個方面對學生進行綜合考核。使學生逐步形成以自主式、合作式、研究式相結(jié)合的學習方式，激發(fā)學生興趣，鍛煉科研思維，培養(yǎng)運用科研思維和系統(tǒng)組合各種實驗技術(shù)來實現(xiàn)科研目標的能力。