方 濤 閆 京 張 明 趙加力 潘 偉 王新宏 周 全
(徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院骨科,江蘇省淮安市 223002,電子郵箱:wuque197928@163.com)
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路在惡性腫瘤中被激活,可調控腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移和化療耐藥[1]。我們在前期研究中發(fā)現mTOR信號通路在人骨肉瘤組織中被激活,且該通路患者的生存期、骨肉瘤對術前化療藥物的反應等密切相關[2]。近年有學者發(fā)現mTOR在腫瘤干細胞的干性維持中發(fā)揮作用[3],但其在骨肉瘤干細胞的干性維持中的具體作用尚不清楚。雷帕霉素是mTOR信號通路的特異性抑制劑,本研究旨在探討mTOR在骨肉瘤干細胞中的表達,以及雷帕霉素對骨肉瘤干細胞增殖和干性維持的影響。
1.1 細胞系及主要試劑、儀器 人骨肉瘤U2OS細胞購自上海佰曄生物科技公司;雷帕霉素膠囊購自華北制藥股份有限公司(批號:181001;規(guī)格:1 mg/粒);兔抗人CD133多克隆抗體(批號:10180423)、八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)抗體(批號:0920108)和SRY盒轉錄因子2(SRY-box transcription factor 2,Sox2)抗體(批號:1804227)均購自美國Santa Cruz公司;RIPA裂解液購自武漢博士德公司(批號:180101);FC型酶標儀購自美國Thermo Fisher公司;Isolex 300i細胞分選儀購自Nexell公司;LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)購自美國UVP公司。四甲基偶氮唑藍比色法試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司(批號:1603211)。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞的培養(yǎng):將U2OS細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基放置于37℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1~2 d更換培養(yǎng)基一次。當細胞生長到覆蓋瓶底壁80%時,用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞,傳代后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中。取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。
1.2.2 免疫磁珠法分離CD133+U2OS細胞:取對數生長期的U2OS骨肉瘤細胞,4℃下1 200 r/min離心4 min,棄去上清液,以3 mL含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)重懸細胞,制成細胞懸液,計數1×108個細胞,加入FcR阻斷試劑(Miltenyi公司,批號:130090482)和CD133磁珠試劑(Miltenyi公司,批號:130090482),4℃孵育30 min,MACS(Miltenyi公司,批號:130042201)磁性分選柱分離CD133+細胞和CD133-細胞。
1.2.3 四甲基偶氮唑藍比色法檢測CD133+U2OS細胞的增殖抑制情況:按照文獻[4]中的方法,取對數生長期的CD133+U2OS細胞,調整細胞密度為1×104個/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,分為預對照組、低劑量雷帕霉素組和高劑量雷帕霉素組,分別加入含0 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL雷帕霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)2.5 mL于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加四甲基偶氮唑藍溶液(5 mg/mL)20 μL,繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),加入150 μL二甲基亞砜,震蕩10 min,采用全自動酶標儀檢測490 nm波長下的吸光度值。計算CD133+U2OS細胞的增殖抑制率(%)=(對照組吸光度值-實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。實驗重復5次。
1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測mTOR、p-mTOR和干性標志蛋白的表達:取對數生長期的CD133+U2OS細胞,分為對照組和雷帕霉素組。對照組使用不含雷帕霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)20 mL,于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),雷帕霉素組使用含適宜劑量雷帕霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,收集細胞,將細胞用4℃的PBS洗滌2次,置于冰上,加入中等強度的RIPA裂解液裂解細胞,4℃、13 000 r/min離心5 min,取上清。采用二喹啉甲酸法(試劑購自江蘇凱基生物技術有限公司,批號:1804062)進行細胞總蛋白濃度測定,制備電泳凝膠,上樣后進行電泳分離蛋白。電泳完畢后轉膜1 h,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入按1 ∶400稀釋的mTOR(Santa Cruz,批號:1311426)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mTOR,p-mTOR;Santa Cruz,批號:1602443)、Sox2、Oct4一抗及甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(以GAPDH作為內參;Santa Cruz,批號:1501226),37℃孵育2 h,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(江蘇凱基生物技術有限公司,批號:1810215;1 ∶300),37℃孵育1 h。通過化學發(fā)光試劑盒 (江蘇凱基生物技術有限公司,批號:1903114)顯影,采用凝膠成像系統(tǒng)對膠片進行掃描與數據采集,每組設5個復孔。實驗重復5次。
1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示,重復測量資料的比較采用重復測量方差分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 雷帕霉素對CD133+U2OS細胞的增殖抑制作用 預對照組CD133+U2OS細胞的增殖抑制率均為0。低劑量雷帕霉素組和高劑量雷帕霉素組CD133+U2OS細胞的增殖抑制率比較,差異有統(tǒng)計學意義(F組間=42.761,P組間<0.001),兩組細胞的增殖抑制率均有隨時間變化的趨勢(F時間=4 988.486,P時間<0.001),分組與時間有交互效應(F交互=13.684,P交互=0.004)。其中,兩組干預48 h后的細胞增殖抑制率均較干預24 h增高(均P<0.05),而干預72 h后與干預48 h后的增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);高劑量雷帕霉素組干預24 h、48 h和72 h后的增殖抑制率均高于低劑量雷帕霉素組。見表1。因此,在后續(xù)的實驗中我們選擇了采用高劑量的雷帕霉素干預48 h(雷帕霉素組)。
表1 兩組CD133+U2OS細胞的增殖抑制率的比較(x±s,%)
2.2 雷帕霉素對CD133+U2OS細胞mTOR的表達及其磷酸化的影響 雷帕霉素組CD133+U2OS細胞中mTOR和p-mTOR蛋白相對表達量均低于對照組(均P<0.05)。見圖1和表2。
圖1 兩組CD133+U2OS細胞中mTOR及p-mTOR的表達情況
表2 兩組CD133+U2OS細胞中mTOR和p-mTOR相對表達量的比較(x±s)
2.3 雷帕霉素對CD133+U2OS細胞干性標志蛋白表達的影響 與對照組相比,雷帕霉素組細胞Sox2和Oct4蛋白相對表達量均下降(均P<0.05)。見圖2和表3。
圖2 兩組CD133+U2OS細胞中Sox2及Oct4的表達情況
表3 兩組CD133+U2OS細胞中干性標志蛋白相對表達量的比較(x±s)
有多項研究顯示腫瘤細胞的干性維持在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、化療耐藥等方面具有重要作用[5-7]。腫瘤干細胞是近年來研究的熱點之一,它具有干細胞的特點,即自我更新、無限增殖及分化潛能,在啟動腫瘤形成和生長中起決定性的作用;同時,其還具有增強DNA修復能力、上調ABC轉運蛋白表達水平等作用[8]。以上作用導致骨肉瘤干細胞在化療中可能通過自我更新、無限增殖等特性逃避化療的毒性作用,引起化療多藥耐藥,導致復發(fā)轉移[8]。作為一種能夠無限自我更新且具有一定分化潛能的細胞,腫瘤干細胞維持自我更新和多項分化潛能(即干性維持)的機制非常復雜,其確切機制目前仍不清楚。
CD133是多種實體腫瘤干細胞共同的表面標志物,CD133+腫瘤細胞較CD133-腫瘤細胞具有更高的自我更新能力和體內成瘤能力[9]。我們在前期的研究中也已發(fā)現CD133+骨肉瘤細胞具有較強的自我更新、多向分化及體內成瘤能力,且其干性標志蛋白的表達更高,具有腫瘤干細胞的特點[10]。因此,我們分離出CD133+U2OS細胞進行干性維持研究。本研究結果顯示,經雷帕霉素干預后,CD133+U2OS細胞的增殖受到了抑制,同時細胞中的干性標志蛋白Sox2和Oct4的表達也下降,提示雷帕霉素不僅可時間-劑量依賴性地抑制CD133+U2OS細胞的增殖,還可抑制細胞的干性維持。
mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶類家族成員,能調控細胞內mRNA的翻譯、蛋白轉運和降解,在細胞生長和代謝、腫瘤化療耐藥中起重要的作用,阻斷mTOR通路可以起到包括抗骨肉瘤在內的廣泛抗腫瘤作用[1]。我們的前期研究的結果顯示,mTOR/p70S6K信號通路高表達的骨肉瘤患者的預后顯著差于低表達的骨肉瘤患者,且該信號通路的高表達與骨肉瘤的化療耐藥、遠處轉移等相關[2]。此外,mTOR信號通路在骨肉瘤干細胞中被激活,并調控骨肉瘤干細胞的化療耐藥[11]。近年來有研究顯示mTOR通路參與了腫瘤干細胞的干性維持[3]。本研究結果顯示,經雷帕霉素干預48 h后,CD133+U2OS細胞的mTOR和p-mTOR的相對表達水平較對照組下降,提示雷帕霉素可以有效地抑制CD133+U2OS細胞中的mTOR信號通路。由此推測,mTOR可能在CD133+U2OS的干性維持中發(fā)揮重要作用,且這種作用可以通過雷帕霉素進行抑制。
綜上所述,雷帕霉素能夠抑制人骨肉瘤CD133+U2OS細胞的增殖和干性維持,這可能與其下降低mTOR信號通路活性有關。