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    基于Sema3A/NRP-1/PlexinA體系探討溫陽(yáng)通絡(luò)方拮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制*

    2021-02-23 09:23:30吳晶金李玲玉栗榮殷世云
    中醫(yī)學(xué)報(bào) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:溫陽(yáng)通貨號(hào)甲氨蝶呤

    吳晶金,李玲玉,栗榮,殷世云

    云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南昆明650021

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。我國(guó)大陸地區(qū)的RA患病率約為0.2%~0.4%。其主要結(jié)局是殘疾,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自然病程中,5~10年的致殘率為60%,病程30年的致殘率為90%,壽命縮短10~15年,而伴關(guān)節(jié)外表現(xiàn)者的5年生存率僅為50%[1],極大影響了患病人群的生活質(zhì)量。開展干預(yù)RA研究對(duì)于人類健康具有重要意義。成纖維樣滑膜細(xì)胞類似腫瘤樣生長(zhǎng)被認(rèn)為是RA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制,臨床抗腫瘤藥物如甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等亦可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。因此,從腫瘤發(fā)病學(xué)角度研究RA,有望發(fā)現(xiàn)全新的治療靶標(biāo)?;谑壬窠?jīng)侵襲(perineural invasion,PNI)在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用,PNI相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體在RA滑膜組織中亦有表達(dá),該研究已為少數(shù)國(guó)外學(xué)者所重視,由此推測(cè)NI可能參與了RA的病理過(guò)程。本研究擬從Sema3A/NRP-1/PlexinA體系探討其作用機(jī)制。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物SPF級(jí)DBA/1雄性小鼠90只,8周齡,體質(zhì)量(21±5)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京):2016-0011,飼養(yǎng)于云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由攝水?dāng)z食。動(dòng)物房溫度維持在22~24℃,濕度維持在65%~70%。

    1.2 藥品與試劑溫陽(yáng)通絡(luò)方(主要由附片、桂枝、麻黃、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中藥組成),由本院藥學(xué)部提供;甲氨蝶呤片,通化茂祥制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào):H22022674)。牛Ⅱ型膠原(CⅡ),sigma公司;完全弗氏佐劑(CFA),美國(guó)BD公司;信號(hào)素(Sema3A)抗體(abcam,貨號(hào):ab23393);神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP-1)抗體(abcam,貨號(hào):ab81321);神經(jīng)叢素(PlexinA)抗體(abcam,貨號(hào):ab23391);β-actin抗體(abmart,貨號(hào):T40104);HRP標(biāo)記通用型二抗(Goat來(lái)源,CST,貨號(hào):7074S);蛋白酶抑制劑(Roche,貨號(hào):11206893001);First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas K1622);SYBR Green master mix(KAPA KK4601);DMEM(H)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco,貨號(hào):12800-017);胎牛血清(Gibco,貨號(hào):10099-141);0.25%胰酶(Gibco,貨號(hào):1894145);凋亡檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué),貨號(hào):AD10)。

    1.3 儀器掌上離心機(jī)(其林貝爾);HITACH低溫離心機(jī)(CF-16RX);全波長(zhǎng)分光光度計(jì)(上海UNICO);酶標(biāo)儀(Thermo);凝膠成像儀(BIO-RAD);垂直電泳槽(BIO -RAD);濕式轉(zhuǎn)膜槽(BIO-RAD);定量PCR儀(ABI StepOne);紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000);超聲破碎儀(美國(guó)Sonnic VCX310);流式細(xì)胞分選儀(Partec GmbH CyFlow Space)。

    2 方法

    2.1 造模及給藥按隨機(jī)數(shù)字表法將DBA/1小鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,甲氨蝶呤組(10 mg·kg-1),溫陽(yáng)通絡(luò)方低、中、高劑量(2.0 g·kg-1、4.0 g·kg-1、8.0 g·kg-1)組,每組5只。除空白組外,其余小鼠均造模。配制濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液,置于4℃冰箱過(guò)夜。冰浴下與CFA按1∶1比例充分混勻,制成乳劑。固定小鼠后于距鼠尾根部1 cm處注射,每只100μL。致炎第21天起每日給予相應(yīng)的藥物干預(yù),模型組與空白組均給予生理鹽水灌胃10 mL·kg-1。第48天末次灌胃后禁食水,第49天脫臼處死。滑膜組織備測(cè)。

    2.2 滑膜組織的收集小鼠處死后,置于冰上操作,仰位固定,迅速離斷四肢,用冷生理鹽水沖洗干凈后沿踝關(guān)節(jié)上方剪下整個(gè)關(guān)節(jié)囊,一部分常規(guī)脫鈣包埋,切片備用,一部分新鮮凍存于超低溫冰箱。

    2.3 滑膜細(xì)胞(FLS)體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取7周齡雄性DBA/1小鼠10只,完全去除皮膚和其他軟組織,無(wú)菌分離各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物踝關(guān)節(jié),操作中始終避免破損導(dǎo)致骨髓細(xì)胞釋放,以漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)沖洗,70%乙醇清洗后將其放入盛有HBSS的100 mm組織培養(yǎng)板中,剪開關(guān)節(jié)間隙。加入含膠原酶IV(終濃度為1 mg·mL-1)的DMEM全培基,搖床中37℃恒溫震蕩消化1 h,渦旋釋放滑膜細(xì)胞后將上清移入新的離心管,加入DMEM 全培基后1 100 r·min-1室溫離心10 min,將沉淀重懸于全培基中,接種培養(yǎng)于37℃,5%CO2孵育箱。傳代培養(yǎng)至第3代,骨髓衍生系完全去除后,第4至8代細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白組、脂多糖(lipoposaccharide,LPS)組、溫陽(yáng)通絡(luò)方組、溫陽(yáng)通絡(luò)方加LPS組,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)滑各組膜細(xì)胞凋亡情況。

    2.4 指標(biāo)的檢測(cè)

    2.4.1 W estern Blot法檢測(cè)滑膜組織每組隨機(jī)選擇3只小鼠的滑膜組織迅速稱重,每100 mg樣本加入8倍體積預(yù)冷的蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑,0.4 mM PMSF,1 mM Iodo,1μM Pepstatin A)勻漿30 min。提取液4℃下,離心半徑8 cm,12 000 r·min-1離心30 min后取上清,BCA法蛋白定量;用PBS調(diào)至等體積,加5×SDS上樣緩沖液,沸水浴5 min;SDS-PAGE凝膠電泳,每孔上樣20μg。配制 5% 積層膠、10% 分離膠,膠厚0.75 mm,膜于轉(zhuǎn)移液(含甲醇15%)中平衡10 min,80 V轉(zhuǎn)膜120 min后將膜取出,放入含5%脫脂奶粉的TBST,室溫封閉1 h。取出膜,對(duì)應(yīng)一抗1∶1 000稀釋,4℃過(guò)夜;TBST洗3次,每次5 min;熒光二抗1∶10 000稀釋,室溫結(jié)合1 h;分別用TBST和PBS各洗3次,每次10 min。使用ODYSSEY 紅外雙色激光成像系統(tǒng)對(duì)Sema3A、NRP-1、PlexinA的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

    2.4.2 RT-PCR法檢測(cè)滑膜組織每組隨機(jī)選擇3只小鼠的滑膜組織于玻璃勻漿器中,滑膜細(xì)胞則直接加入Trizol,以離心柱法提取總RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Sema3A、NRP-1、PlexinA基因表達(dá)水平。(在pubmed上查詢對(duì)應(yīng)物種的目的基因mRNA序列,以CDS序列設(shè)計(jì)引物。應(yīng)用beacon designer 7.90設(shè)計(jì)Q-PCR引物,引物序列見表1。

    表1 引物序列

    2.4.3 流式法檢測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡將滑膜細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、LPS組、溫陽(yáng)通絡(luò)方組、溫陽(yáng)通絡(luò)方加LPS組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,移除細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS清洗細(xì)胞3次,0.25%胰酶消化收集細(xì)胞。PBS清洗收集好的細(xì)胞3次,離心半徑8 cm,1 000 rmp·min-1離心3 min,收集細(xì)胞,用400μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,每組每個(gè)復(fù)孔均勻分成4管。第1管為空白組(不加任何試劑)、第2管為FITC對(duì)照組(加入5μL的Annexin V-FITC)、第3管為PI對(duì)照組(加入5 μL的PI)、第4管雙染組(加入5μL Annexin VFITC和5μL PI),室溫避光孵育15 min。用PBS將每管液體量補(bǔ)至1 mL后,在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)細(xì)胞凋亡,以1~3管為組合對(duì)照,以雙染組分析滑膜細(xì)胞凋亡情況。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)小鼠滑膜組織PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表達(dá)的影響與空白組相比,模型組小鼠滑膜組織中PlexinA、Sema3A、NRP-1的表達(dá)量明顯升高(P<0.05),與相關(guān)文章中趨勢(shì)一致;與模型組相比,溫陽(yáng)通絡(luò)方各劑量和甲氨蝶呤組可明顯升高PlexinA的表達(dá)量(P<0.05);溫陽(yáng)通絡(luò)方高劑量組和甲氨蝶呤組可明顯升高Sema3A的表達(dá)量(P<0.05);溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中劑量組和甲氨蝶呤組可明顯升高NRP-1的表達(dá)量(P<0.05)。見圖1、表2。

    圖1 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)小鼠滑膜PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表達(dá)水平的影響

    表2 溫陽(yáng)通絡(luò)方各組p lexinA、Sema3A、NRP-1的表達(dá)(±s)

    表2 溫陽(yáng)通絡(luò)方各組p lexinA、Sema3A、NRP-1的表達(dá)(±s)

    注:與模型組相比,△P<0.05

    組別n plexinA Sema3A NRP-1空白組3 0.85±0.06△1.07±0.16△0.94±0.14△模型組3 0.41±0.15 0.64±0.09 0.65±0.05甲氨蝶呤組3 0.77±0.07△1.03±0.17△0.90±0.20△溫陽(yáng)通絡(luò)方高劑量組3 0.81±0.19△1.02±0.18△0.94±0.08△溫陽(yáng)通絡(luò)方中劑量組3 0.68±0.04△0.87±0.06 0.92±0.14△溫陽(yáng)通絡(luò)方低劑量組3 0.61±0.06△0.70±0.04 0.76±0.10

    3.2 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組PlexinA m RNA、Sema3A m RNA、NRP-1 m RNA表達(dá)水平的影響與空白組相比,模型組可明顯降低PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。與模型組相比,溫陽(yáng)通絡(luò)方各劑量組和甲氨蝶呤組可升高PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。見表3。

    表3 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表達(dá)水平的影響(±s)

    表3 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表達(dá)水平的影響(±s)

    注:與模型組相比,△P<0.05

    mRNA空白組3 1.00±0.00△1.00±0.00△1.00±0.00組別n PlexinA mRNA Sema3A mRNA NRP-1△模型組3 0.24±0.03 0.23±0.03 0.22±0.03甲氨蝶呤組3 0.84±0.08△0.85±0.07△0.85±0.06△溫陽(yáng)通絡(luò)方高劑量組3 0.86±0.06△0.86±0.07△0.89±0.05△溫陽(yáng)通絡(luò)方中劑量組3 0.58±0.09△0.50±0.06△0.50±0.06△溫陽(yáng)通絡(luò)方低劑量組3 0.30±0.02△0.29±0.04△0.30±0.06△

    3.3 滑膜細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)與正常組相比,溫陽(yáng)通絡(luò)方+LPS組、溫陽(yáng)通絡(luò)方組滑膜細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與LPS組相比,溫陽(yáng)通絡(luò)方+LPS組、溫陽(yáng)通絡(luò)方組滑膜細(xì)胞凋亡率明顯(P<0.05)。見圖2、表4。

    圖2 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組滑膜細(xì)胞凋亡率的影響

    表4 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組滑膜細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

    表4 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)各組滑膜細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

    注:與正常組相比,*P<0.05,與LPS組相比,△P<0.05

    /%LPS組組別n凋亡率1.11±0.06正常組3 2.53±0.12溫陽(yáng)通絡(luò)方+LPS組3 15.01±0.03*△溫陽(yáng)通絡(luò)方組3 37.02±1.61 3*△

    4 討論

    溫陽(yáng)通絡(luò)方是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)吳生元教授基于“陽(yáng)虛絡(luò)痹”理論總結(jié)出的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效驗(yàn)方。全方由附片、桂枝、麻黃、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中藥組成,具有溫陽(yáng)散寒、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功,主治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證或風(fēng)寒濕痹證。前期研究證實(shí),溫陽(yáng)通絡(luò)方具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及抑制骨破壞的作用[2-5]?!吨胁亟?jīng)》指出:“陽(yáng)者生之本,陰者死之基,陰宜長(zhǎng)損,陽(yáng)宜長(zhǎng)益,順陽(yáng)者生,逆陽(yáng)者死”“陽(yáng)化氣,陰成形”,陽(yáng)氣流通,陰氣無(wú)滯,自然百病不作。陽(yáng)衰陰長(zhǎng),風(fēng)寒濕乘虛侵襲,具體表現(xiàn)在有形陰邪積聚。因此,陽(yáng)虛邪乘,絡(luò)脈痹阻可能是滑膜發(fā)生嗜神經(jīng)侵襲的病機(jī)所在。

    Sema3A/NRP-1/PlexinA復(fù)合體在RA滑膜組織的表達(dá)證實(shí)了嗜神經(jīng)侵襲可能是RA發(fā)病的重要機(jī)制。Sema3A具有免疫調(diào)節(jié)的作用,它能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NRP-1[6-15]。研究顯示,Sema3A能完全阻斷VEGF165信號(hào)通路,因此,其表達(dá)減少能加劇RA病程[16-20]。而NRP-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由PlexinA共受體實(shí)現(xiàn)的。Sema3A/NRP-1/PlexinA復(fù)合體通過(guò)小G蛋白家族的Rac和Rho實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞微絲骨架的調(diào)控。其中,Rac家族與B淋巴細(xì)胞增殖激活和樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞激活密切相關(guān)[21-22]。由此可見,Sema3A/NRP-1/PlexinA調(diào)控體系參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程,其對(duì)RA的調(diào)控可能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)及抗滑膜新生血管形成發(fā)揮作用。

    綜上所述,嗜神經(jīng)侵襲可能參與滑膜增殖,是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Sema3A/NRP-1/PlexinA調(diào)控體系在滑膜病程中可能有重要作用,其可能通過(guò)影響滑膜細(xì)胞凋亡等抑制炎癥反應(yīng)發(fā)展。Sema3A/NRP-1/PlexinA體系可能是溫陽(yáng)通絡(luò)方治療RA的效驗(yàn)靶點(diǎn)。

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