溫陽(yáng)通絡(luò)方抗膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜新生血管形成的機(jī)制研究*

殷世云，吳晶金

（云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身炎性免疫病[1]。我國(guó)患病率約為0.2%～0.4%[2]，具有較高的致殘率，如不及早合理治療，3年內(nèi)關(guān)節(jié)破壞可達(dá)70%。在歐美國(guó)家，RA年經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過(guò)400億歐元，因此開(kāi)展干預(yù)RA的研究具有重要戰(zhàn)略意義。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要病理特征就是滑膜血管翳，新生血管形成在RA進(jìn)程中扮演重要角色，被認(rèn)為是疾病由急性向慢性轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究旨在以溫陽(yáng)通絡(luò)方為研究載體，探討其干預(yù)RA新生血管形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性 DBA/1小鼠90只，8周齡，體質(zhì)量（18±3）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）：2016-0011。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由攝食攝水，動(dòng)物房溫度維持在22～24℃，濕度維持在65%～70%。

1.2 藥品 牛II型膠原（C II）購(gòu)自sigma公司；完全弗氏佐劑（CFA）購(gòu)自BD公司；溫陽(yáng)通絡(luò)方（主要由附片、桂枝、麻黃、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中藥組成），由本院成藥房提供。甲氨蝶呤片，通化茂祥制藥有限公司（批號(hào)：H22022674）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為甲氨蝶呤組、模型組、空白對(duì)照組、溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組，每組5只小鼠。

1.3.2 動(dòng)物造模 空白對(duì)照組小鼠不做處理，其余小鼠均進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)前1 d配制2 mg/mL的牛II型膠原溶液，置于4℃冷藏過(guò)夜。冰浴下與 CFA按照1∶1比例充分混勻，制成乳劑。固定小鼠后，在距鼠尾根部 1 cm處以每只100 μL注射。

1.3.3 給藥方法 從致炎第21天開(kāi)始給藥干預(yù)，溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組分別以 8.0、4.0、2.0 g/kg溫陽(yáng)通絡(luò)方水溶液每天灌胃，甲氨蝶呤組按10 mg/kg每周給予甲氨蝶呤水溶液灌胃1次；模型組與空白對(duì)照組按10 mL/kg每天給予生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間均予SPF級(jí)普通飼料。第48天末次灌胃后禁食水，第49天脫臼處死，滑膜組織備測(cè)。

1.3.4 滑膜組織的收集 小鼠處死后，仰位固定，置于冰上操作，離斷四肢，用冷生理鹽水沖洗干凈后，沿踝關(guān)節(jié)上方剪下整個(gè)關(guān)節(jié)囊，一部分常規(guī)脫鈣包埋，切片備用；一部分新鮮凍存于超低溫冰箱。

1.3.5 HE染色 石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化：二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min→無(wú)水乙醇10 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→蒸餾水I 5 min→蒸餾水II 5 min。蒸餾水洗滌5 min。蘇木素染色16 min，洗去浮色，1%鹽酸酒精分化2 s（濃鹽酸1 mL加入99 mL的75%無(wú)水乙醇中配制）。自來(lái)水返藍(lán)。伊紅染色10 min，自來(lái)水終止顯色。梯度酒精脫水10 min，二甲苯透明30 min，中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

1.3.6 滑膜組織的免疫組化檢測(cè) 對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物滑膜組織石蠟標(biāo)本行病理學(xué)常規(guī)染色，另取切片做免疫組化檢測(cè)。取各組標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，浸入檸檬酸鹽緩沖液中，微波加熱至沸騰，中檔微波處理10 min，自然泠卻，用0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次。3%過(guò)氧化氫封閉，避光，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。5%羊血清室溫封閉1 h。去除多余的封閉液，加一抗稀釋液，4℃冰箱過(guò)夜。次日用0.01 mol/L PBST漂洗 5 min×4次。滴加 PV9000試劑 I，37℃孵育 30 min，0.01 M PBST漂洗5 min×3次，滴加PV9000試劑 II，37 ℃孵育 30 min，0.01 mol/L PBST 漂 5 min×4次；滴加DAB顯色液，室溫避光孵育5 min。蒸餾水沖洗，終止顯色。蘇木素復(fù)染2 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。每組于高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照。用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析各組小鼠滑膜組織Ang-2、VEGF表達(dá)。

1.3.7 滑膜組織Western blot檢測(cè) 取各組動(dòng)物滑膜組織迅速稱重，每100 mg樣本加入預(yù)冷的8倍體積蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制劑：0.4 mM PMSF，1 mM Iodo，1 μM Pepstatin A）勻漿 30 min。提取液 4℃下12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法蛋白定量；PBS調(diào)至等體積，加5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min；SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣 20 μg，配膠，將膜于轉(zhuǎn)移液（含甲醇15%）中平衡10 min，80 V轉(zhuǎn)膜120 min后將膜取出，置于含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h。取出膜，對(duì)應(yīng)一抗1∶1 000稀釋，4℃過(guò)夜；TBST洗3次，每次5 min；熒光二抗1∶10 000稀釋，室溫結(jié)合1 h；分別用TBST和PBS各洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY紅外雙色激光成像系統(tǒng)對(duì)Ang-2、VEGF相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，相關(guān)抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA）。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)DBA/1小鼠及踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 造模前（0 d）、造模35 d，各組DBA/1小鼠足趾容積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模48 d，各組足趾容積與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻捉M、甲氨蝶呤組、溫陽(yáng)通絡(luò)方低、中、高劑量組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻捉M、模型組、溫陽(yáng)通絡(luò)方低、中劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），溫陽(yáng)通絡(luò)高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)CIA小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（±s，n=5）

表1 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)CIA小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（±s，n=5）

注：與空白對(duì)照組同期比較，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與甲氨蝶呤組同期比較，▲▲P＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型組146.20±4.21 149.60±4.83 153.80±3.42△△▲▲-156.00±5.79 158.00±6.82 352.40±6.73**▲▲甲氨蝶呤組 10 mg/kg 156.60±10.26 158.00±9.35 210.20±6.06**△△劑量 0 d 35 d 48 d-溫陽(yáng)通絡(luò)方低劑量組 2.0 g/kg 155.00±3.93 157.40±2.07 323.80±43.75**△▲▲溫陽(yáng)通絡(luò)方中劑量組 4.0 g/kg 148.80±10.71 151.60±11.28 255.20±21.37**△△▲▲溫陽(yáng)通絡(luò)方高劑量組 8.0 g/kg 162.00±9.67 164.60±9.04 194.60±15.90**△△

2.2 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)DBA/1小鼠滑膜組織炎癥的影響模型組滑膜組織HE染色提示有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜細(xì)胞增生；甲氨蝶呤組、溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組僅有少量淋巴細(xì)胞，未見(jiàn)明顯滑膜細(xì)胞增生，見(jiàn)圖1。

2.3 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)DBA/1小鼠滑膜新生血管的影響免疫組化DAB染色，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色，模型組DBA/1小鼠滑膜組織中有大量Ang-2蛋白表達(dá)，甲氨蝶呤組、溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組中Ang-2蛋白表達(dá)水平明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.4 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)DBA/1小鼠滑膜新生血管的影響免疫組化DAB染色，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色，模型組DBA/1小鼠滑膜組織中有大量VEGF蛋白表達(dá)，甲氨蝶呤組、溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組中VEGF蛋白表達(dá)水平明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖 3。

2.5 溫陽(yáng)通絡(luò)方對(duì)小鼠滑膜組織Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)水平的影響 空白組、模型組、甲氨蝶呤組、溫陽(yáng)通絡(luò)方高、中、低劑量組Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低，見(jiàn)圖4。

3 討論

溫陽(yáng)通絡(luò)方是云南省名老中醫(yī)吳生元教授基于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎“陽(yáng)虛絡(luò)痹”理論總結(jié)出的效驗(yàn)方，已開(kāi)發(fā)為院內(nèi)制劑在中醫(yī)醫(yī)療集團(tuán)50余家單位使用10余年，該方主要由附片、桂枝、麻黃、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中藥組成，具有溫經(jīng)通絡(luò)、散寒止痛之功，主治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻或風(fēng)寒濕痹證?！吨胁亟?jīng)》有：“陽(yáng)者生之本，陰者死之基，陰宜長(zhǎng)損，陽(yáng)宜長(zhǎng)益，順陽(yáng)者生，逆陽(yáng)者死”“陽(yáng)化氣，陰成形”，陽(yáng)氣周流，自然百病不作。陽(yáng)衰陰長(zhǎng)，風(fēng)寒濕乘虛侵襲，具體表現(xiàn)在有形陰邪積聚——即大量滑膜新生血管形成。因此，陽(yáng)虛邪乘，絡(luò)脈痹阻可能是滑膜新生血管形成的病機(jī)所在。前期臨床研究顯示，溫陽(yáng)通絡(luò)方能改善RA患者證候積分及 DAS28、CDAI、SDAI等評(píng)分[3-6]，總有效率93.57%；實(shí)驗(yàn)研究顯示其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用[7-12]。

RA滑膜血管翳富集大量炎癥細(xì)胞及因子，同時(shí)也阻斷了關(guān)節(jié)軟骨營(yíng)養(yǎng)吸收，在關(guān)節(jié)病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，抗滑膜新生血管形成可能是RA治療的新思路[13-16]。其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RA滑膜纖維母細(xì)胞以及吞噬樣細(xì)胞能夠較高水平的表達(dá)VEGF[17-20]，該因子是滑膜血管翳形成過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，而Ang-2對(duì)血管新生具有雙重作用，當(dāng)滑膜中VEGF含量豐富時(shí)，Ang-2抑制Tie-2受體磷酸化，促進(jìn)血管的新生和增生[21-22]。

本次研究提示溫陽(yáng)通絡(luò)方能抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜新生血管形成，其作用可能與下調(diào)滑膜組織Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)水平有關(guān)，進(jìn)而減輕血管翳形成，有關(guān)作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。