芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

楚麗杰，劉 卉，羅文連，張 涵，楊寶玉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250014）

高雄激素血癥（hyperandrogenemia，HA）是一種以雄激素過(guò)多為生化指標(biāo)，月經(jīng)異常、痤瘡、多毛、脫發(fā)等為臨床表現(xiàn)的疾病[1-2]。其誘因包括多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、腎上腺皮質(zhì)增生、雄激素分泌性腫瘤等，約95%的HA婦女患有PCOS[3]。HA不僅是PCOS的病理學(xué)特征之一，也是其核心病因[4]，HA可抑制卵泡的發(fā)育和成熟，不能形成優(yōu)勢(shì)卵泡，從而影響排卵與行經(jīng)[5]，并且增加子宮內(nèi)膜癌、糖尿病和心腦血管疾病的發(fā)生率。因此，對(duì)HA的干預(yù)成為PCOS診治的核心舉措之一。

芍藥甘草湯出自《傷寒雜病論》，歷代醫(yī)家對(duì)本方的作用趨同于白芍酸斂補(bǔ)益陰血，甘草補(bǔ)益中焦。白芍的關(guān)鍵作用在于抑木扶土、疏泄破積。甘草有斂降太陰脾氣的作用，通過(guò)降以為補(bǔ)，達(dá)到恢復(fù)臟腑陰陽(yáng)之功效[6]。王好古在《湯液本草》中提出了肝苦急，以甘草之甘緩之、白芍之酸瀉之等處方用藥規(guī)律。臨床研究表明，芍藥甘草湯可有效作用于HA及PCOS[7-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，芍藥甘草湯可以降低睪酮值，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に豙11]，提高了HA患者的生活質(zhì)量。

中醫(yī)藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮作用。雖然芍藥甘草湯干預(yù)多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的作用明確，但關(guān)于其發(fā)揮作用的主要成分、潛在靶點(diǎn)、生物過(guò)程等研究少見(jiàn)。本次通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析、預(yù)測(cè)芍藥甘草湯的成分、靶點(diǎn)及作用于多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的藥物機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 芍藥甘草湯有效活性成分的檢索與篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索白芍、甘草的所有活性成分，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、半衰期（half-life period，HL）、類藥性（drug-like property，DL）是篩選的關(guān)鍵參數(shù)，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的有效活性成分。

1.2 芍藥甘草湯潛在靶點(diǎn)收集及可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索白芍、甘草有效活性成分的作用靶點(diǎn)。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)定為“人”，將所獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行名稱轉(zhuǎn)換，以解決中藥靶點(diǎn)存在的名稱不標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題。借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。從而得到芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的主要有效活性成分。

1.3 疾病靶點(diǎn)的檢索與預(yù)測(cè) 以“polycystic ovary syndrome hyperandrogenemia”為關(guān)鍵詞，運(yùn)用Genecards、Drugbank、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的治療靶點(diǎn)。

1.4 藥物與疾病靶點(diǎn)的匹配及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 利用VENNY圖將芍藥甘草湯有效活性成分作用的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到芍藥甘草湯與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建 PPI圖。并借用Cytoscape3.7.2軟件中的MCODE插件，篩選出PPI中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，以獲得芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因功能及作用通路分析 運(yùn)用David數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，闡明芍藥甘草湯對(duì)多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的生物學(xué)功能及相關(guān)信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 白芍、甘草的有效活性成分及作用靶點(diǎn) 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標(biāo)準(zhǔn)，共得到83個(gè)有效活性成分，其中白芍10個(gè)，甘草76個(gè)，重合3個(gè)。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索活性成分作用靶點(diǎn)，共得到1 482個(gè)，剔除重復(fù)后得到244個(gè)。將其借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行名稱轉(zhuǎn)化，刪除“人”中沒(méi)有的，最終得到233個(gè)。

2.2 芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將白芍、甘草的有效活性成分及作用靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。其中紅色正方形代表2種中藥白芍、甘草；藍(lán)色圓形代表中藥所對(duì)應(yīng)的活性成分，其大小與活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目呈正比；黃色圓形代表2種中藥的共有活性成分。將degree排名前10的活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的數(shù)目整合至表格中，見(jiàn)表1。由此得出排名最前的活性成分為槲皮素，其次為山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、刺芒柄花素等。

表1 芍藥甘草湯中靶點(diǎn)數(shù)目排名前10的活性成分

2.3 多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的相關(guān)靶點(diǎn)運(yùn)用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得103個(gè)基因，刪除重復(fù)后得101個(gè)；運(yùn)用Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Targets”為條件，共得到98個(gè)靶點(diǎn)，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，刪除重復(fù)及“人”中沒(méi)有的，得到77個(gè)基因；運(yùn)用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，以“gene with known sequence”為篩選條件，共得到4 860個(gè)基因，刪除1個(gè)重復(fù)基因后共得到4 859個(gè)。將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因整合，去除重復(fù)后共得到4 947個(gè)。

2.4 藥物與疾病靶點(diǎn)匹配及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用VENNY圖將芍藥甘草湯與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲得共同靶點(diǎn)125個(gè)，見(jiàn)圖2。將共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選為“Homo sapiens”，置信度≥0.40，構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)，將所獲得的數(shù)據(jù)下載為TSV格式，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，以中位數(shù)（degree值）>35為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出PPI中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。靶點(diǎn)大小與degree值呈正比，靶點(diǎn)越大代表所發(fā)揮的作用越強(qiáng)，獲得41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)degree值排序，排名前15的靶點(diǎn)基因見(jiàn)表2。

表2 排名前15的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO基因功能富集分析 將41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因列表，標(biāo)識(shí)碼為OFFICIAL GENE SYMBOL，清單類型為基因表，選擇物種為“Homo sapiens”，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，設(shè)定閾值P＜0.01。將GO富集結(jié)果按P值由小到大排序，P值的大小與富集程度呈負(fù)相關(guān)，排名靠前的結(jié)果見(jiàn)表3，其中12個(gè)靶點(diǎn)參與了蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控，8個(gè)靶點(diǎn)參與了脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路，9個(gè)靶點(diǎn)參與了NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控，8個(gè)靶點(diǎn)參與了細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)等。2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析主要涉及107條通路，以P值為排序標(biāo)準(zhǔn)，P值的大小與關(guān)聯(lián)程度呈負(fù)相關(guān)，其中與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥密切相關(guān)前20條通路包括癌癥通路、TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體、催乳素等信號(hào)通路，見(jiàn)表4。

表3 GO功能富集分析

3 討論

HA是PCOS的一個(gè)重要病因，可呈現(xiàn)出一系列生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能異常癥候群，雄激素對(duì)婦女健康的最顯著影響是PCOS婦女的HA[12]。“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖看出，芍藥甘草湯治療的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、刺芒柄花素等。槲皮素能降低CYP17A1基因的表達(dá)，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶以減少雄激素的合成[13]，刺芒柄花素可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，來(lái)影響炎癥因子的呈現(xiàn)[14]，進(jìn)而抑制了雄激素的合成。槲皮素與山奈酚都屬于黃酮類化合物，具有明顯的抗炎作用[15]，炎癥因子水平往往與雄激素水平呈正相關(guān)[16]。由此得出，芍藥甘草湯主要通過(guò)抗炎特性來(lái)發(fā)揮治療疾病的作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA等是芍藥甘草湯治療本病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MAPK3在卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[17]，其可能受雄激素調(diào)節(jié)，在PCOS中的表達(dá)下降[18]。Karimzadeh L 等[19]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制 IL-6、COX-2、VEGF、TNF等可降低PCOS患者的雄激素水平。另有發(fā)現(xiàn) PCOS患者的 MMP9、STAT3濃度較高[20-21]，STAT3可以促進(jìn)IL-6發(fā)揮其抗炎特性，MMP9可通過(guò)釋放VEGF參與血管生成。由此可知，芍藥甘草湯可以上調(diào)MAPK3促進(jìn)排卵及卵泡黃素化，通過(guò)作用于 MMP9、STAT3 來(lái)抑制 TNF、IL-6、VEGF 等炎癥和血管生成因子，以達(dá)到干預(yù)疾病的目的。

GO富集分析顯示，芍藥甘草湯可參與蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物過(guò)程。NF-κB通路可以通過(guò)介導(dǎo)脂多糖來(lái)促進(jìn)IL-6的表達(dá)[22]。氧化應(yīng)激和缺氧會(huì)加速AGE前體的產(chǎn)生，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，進(jìn)而形成HA[23]。以上研究說(shuō)明了芍藥甘草湯通過(guò)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程來(lái)治療本病。

KEGG通路分析顯示，芍藥甘草湯可作用于癌癥、TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體等信號(hào)通路。雄激素水平升高可增加子宮內(nèi)膜增生、癌變的風(fēng)險(xiǎn)[24-25]。Torchen LC等[26]將HA婦女與非HA婦女相比，患轉(zhuǎn)移性腫瘤和糖代謝障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加。TNF-α水平在PCOS患者中顯著升高，大幅度增加了初級(jí)卵泡的數(shù)目[27]。HIF-1α及其下游蛋白內(nèi)皮素-2對(duì)卵泡的發(fā)育及排卵發(fā)揮重要的作用[28]，而其在PCOS大鼠卵巢被顯著抑制[29]。FoxO可抑制PCOS巨噬細(xì)胞中葡萄糖的攝取[30-31]，并促其產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[32]。雄激素會(huì)導(dǎo)致脂肪分解，增加游離脂肪酸，而游離脂肪酸的主要配體是Toll樣受體[33]。說(shuō)明芍藥甘草湯不僅可調(diào)節(jié)糖脂代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮、參與炎癥反應(yīng)，還可作用于多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的遠(yuǎn)期并發(fā)癥。

綜上所述，芍藥甘草湯中槲皮素、山奈酚、刺芒柄花 素 等 可 通 過(guò) MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA 等靶點(diǎn)作用于 TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體等信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)糖脂代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮、參與炎癥反應(yīng)，以減少雄激素的合成。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，7-甲氧基-2-甲基異黃酮、β-谷甾醇等也可能是主要活性成分，MYC、PTGS2、EGFR、MAPK1、AKT1、TP53 等可能是其作用靶點(diǎn)，乙型肝炎、催乳素信號(hào)通路、胰島素抵抗等可能是其作用通路，為今后深入探討芍藥甘草湯干預(yù)多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的作用機(jī)制開(kāi)辟了新思路。