伴視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者外周血CD19+B細(xì)胞中基因差異表達(dá)及相關(guān)通路的研究

許 思

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)性疾病，以炎癥性、脫髓鞘性及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性為主要特征。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)及灰質(zhì)的炎性病變是多發(fā)性硬化的主要發(fā)病原因，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞損傷的原因[1，2]，其致病原因尚不明確，研究表明多種促炎因子的釋放和免疫細(xì)胞的激活在多發(fā)性硬化的致病過程中起到了重要的作用。目前，多發(fā)性硬化的診斷是十分困難的，多發(fā)性硬化的經(jīng)典診斷手段主要依賴于患者病史、臨床癥狀、體格檢查以及各種輔助檢查如核磁共振、腦脊液和血的實(shí)驗(yàn)室檢查、電生理學(xué)檢查等方式的綜合判斷[3]?，F(xiàn)應(yīng)用于臨床診斷多發(fā)性硬化的生物學(xué)標(biāo)志物主要有糖蛋白、趨化因子、IgG、IgM抗體以及細(xì)胞表面標(biāo)志物等[4]，但仍缺乏特異性好及敏感性高的生物學(xué)指標(biāo)。多發(fā)性硬化疾病表現(xiàn)的復(fù)雜性導(dǎo)致了這些生物學(xué)標(biāo)志物與疾病的診斷難以建立良好的關(guān)聯(lián)性以及指導(dǎo)意義。因此，識(shí)別多發(fā)性硬化患者中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)新的特異性標(biāo)志物，從分子水平挖掘多發(fā)性硬化的致病機(jī)制，可以為多發(fā)性硬化的診治提供新的方向。

視神經(jīng)炎是多發(fā)性硬化的常見臨床表現(xiàn)之一，約有25%的MS患者的主要癥狀為視神經(jīng)炎，且約有30%～70%的MS患者可在多發(fā)性硬化的整個(gè)病程中出現(xiàn)此癥狀。視神經(jīng)炎的病理改變包含一個(gè)與軸索丟失相關(guān)的復(fù)雜的髓鞘脫失和再生的過程，盡管疾病的機(jī)制與炎性脫髓鞘相關(guān)，但其觸發(fā)成分尚不清楚。多發(fā)性硬化的癥狀多變且不可預(yù)測(cè)，但許多MS患者由于視神經(jīng)脫髓鞘而導(dǎo)致視力急劇下降并難以恢復(fù)，且對(duì)于此種視神經(jīng)炎缺乏良好的康復(fù)方法，使得許多患者遺留下視力的殘疾，亦對(duì)患者的工作和生活產(chǎn)生了巨大的不便。

近年來，隨著基于基因芯片的高通量測(cè)序平臺(tái)的建立使得在癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病等多種領(lǐng)域疾病的分子層面上的相關(guān)致病機(jī)制研究有了突破性的進(jìn)展，同時(shí)成為篩選疾病發(fā)生過程中的重要遺傳物質(zhì)、識(shí)別及診斷疾病預(yù)后的關(guān)鍵性生物學(xué)標(biāo)志物的一種重要的方法和工具[5]。

本研究通過檢索Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中伴視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化相關(guān)研究的基因數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步挖掘相關(guān)差異表達(dá)的基因，通過GEO、KEGG[6]等在線數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)分析多發(fā)性硬化患者中差異表達(dá)基因的相互作用關(guān)系及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從分子層面深入研究多發(fā)性硬化發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制，為伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者的進(jìn)一步診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來源 通過NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/)中檢索多發(fā)性硬化患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并下載多發(fā)性硬化患者的基因芯片表達(dá)譜(GSE62584)，該表達(dá)譜包括15個(gè)外周血CD19+B細(xì)胞樣本，來自于6個(gè)伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者以及9個(gè)正常人，所取組織為外周血CD19+B細(xì)胞，患者的外周血均取自首次發(fā)生急性脫髓鞘性視神經(jīng)炎患者發(fā)病的96 h內(nèi)。

1.2 基因差異表達(dá)分析 下載GSE62584后，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)，P值<0.05和差異倍數(shù)|logFC|>1為差異表達(dá)基因。上述分析采用GEO2R(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/geo2r/)在線分析軟件進(jìn)行，同時(shí)使用R包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析繪圖。

1.3 通路富集分析和基因本體分析 通路富集分析和基因本體(Gene Ontology，GO)功能分析通過 DAVID[7](http：//david. abcc. ncifcrf. gov/)數(shù)據(jù)庫中的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集方法和GO功能富集方法進(jìn)行分析，P值及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)均≤0.5即視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物通路和GO通路。

1.4 蛋白相互作用分析 利用STRING-DB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用分析。

2 結(jié) 果

2.1 基因差異表達(dá)分析 首先，我們將所得到得差異基因表達(dá)譜計(jì)算數(shù)據(jù)值分布，并將其可視化，由箱型圖我們可以看研究樣本經(jīng)處理后數(shù)據(jù)均一性良好，兩組之間樣本具有可比性(見圖1)。其次，我們將所有發(fā)現(xiàn)的差異基因的數(shù)據(jù)利用t檢驗(yàn)分析出兩樣本間顯著差異表達(dá)的基因后，以log2(fold change)為橫坐標(biāo)，以t檢驗(yàn)顯著性檢驗(yàn)P值的負(fù)對(duì)數(shù)-log10(P-value)為縱坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布情況進(jìn)行可視化繪圖，得到Volcano plot(見圖2)。選取差異表達(dá)最顯著的前50個(gè)基因繪制熱圖(見圖3)，可見該基因數(shù)據(jù)具有顯著的差異性。

圖1 GSE62584基因數(shù)據(jù)集箱型圖分析(粉色代表多發(fā)性硬化患者，藍(lán)色代表正常對(duì)照)

圖2 GES62584全部基因數(shù)據(jù)集火山圖Volcano plot

圖3 GES62584基因數(shù)據(jù)集熱圖分析

在GEO2R平臺(tái)中分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組數(shù)據(jù)分組，選取P<0.05及|logFC|>1的基因，去除Gene. symbol為空白的基因，一共有561個(gè)差異基因可以納入標(biāo)準(zhǔn)，其中以logFC均呈現(xiàn)正值標(biāo)記為上調(diào)基因：212個(gè)，以logFC均呈現(xiàn)負(fù)值標(biāo)記為下調(diào)基因：349個(gè)，其中差異最顯著的為IL4R，P=0.00000673。

2.2 差異表達(dá)基因的通路分析 以“|logFC|>1、P<0.05”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出561個(gè)基因符合標(biāo)準(zhǔn)，將目標(biāo)基因數(shù)據(jù)通過基因差異表達(dá)分析所篩選出的基因通過 DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/home. jsp)數(shù)據(jù)庫中的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集方法和GO功能富集方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中所鑒定出的差異靶基因主要作用集中在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(見表1)。共有20個(gè)差異基因富集于細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作通路中，P<0.05(見圖4)，提示細(xì)胞因子互作在伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化中起到了重要的作用。

圖4 KEGG 通路分析結(jié)果

表1 GO生物學(xué)過程

2.3 通過 STRING-database 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用之間的分析 通過STRING-DB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因相互作用的分析，共同構(gòu)成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多中心預(yù)測(cè)差異靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5)。其中有123條邊，節(jié)點(diǎn)平均度為2.83，相互作用的差異靶基因主要是：RGS7、PDCL、IL4R、IL4、GNG7等。

圖5 蛋白功能性富集結(jié)果

3 討 論

神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病種類繁多且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化可能與環(huán)境、遺傳及免疫等方面有關(guān)，由于發(fā)病機(jī)制尚不明確，診斷篩查較為困難，缺乏特異性的生物標(biāo)志物和特異性診斷方法[8]。本研究通過基因芯片的方法利用高通量數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法從基因水平進(jìn)一步的探尋了伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者中的關(guān)鍵基因，我們得到了561個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步通過DAVID進(jìn)行GO與KEGG富集分析，深度從分子生物學(xué)層面挖掘關(guān)基因在疾病中的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)GO富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)的基因主要參與了免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控。大量研究表明，免疫細(xì)胞、免疫球蛋白參與的免疫調(diào)控機(jī)制在神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的發(fā)病中起到了重要的作用，是自身產(chǎn)生細(xì)胞免疫的重要機(jī)制[9]。伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者中異常表達(dá)的基因參與的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，在疾病的致病中發(fā)揮了重要的作用。

通過我們的研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)KEGG信號(hào)通路富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作通路(Cytokine-cytokine receptor interaction，hsa04060)。細(xì)胞因子是可溶性的細(xì)胞外蛋白或糖蛋白，是細(xì)胞間調(diào)節(jié)和動(dòng)員的關(guān)鍵因子，細(xì)胞因子參與先天性和適應(yīng)性炎癥的宿主防御、細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞死亡、血管生成、發(fā)育和修復(fù)等過程，目的是維持體內(nèi)的平衡[10]。因子，細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用的通路與自身免疫病中的免疫炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。伴視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者中基因表達(dá)異常，存在大量基因表達(dá)的上調(diào)與下調(diào)，也驗(yàn)證了目前的一些研究：固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均參與發(fā)病。這類患者可能同時(shí)存在免疫功能的亢進(jìn)和抑制，因此炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱處于不斷的變化之中。由此可見，本研究篩選的差異基因及關(guān)鍵通路在伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化患者發(fā)病的相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)扮演了重要的角色，在我們后續(xù)的研究中需要進(jìn)一步驗(yàn)證這些關(guān)鍵基因及通路在疾病中發(fā)揮的功能。

多發(fā)性硬化相關(guān)性視神經(jīng)炎不同于視神經(jīng)脊髓炎，多發(fā)性硬化相關(guān)性視神經(jīng)炎多為單眼視力下降，可表現(xiàn)為不同程度的視乳頭水腫或球后視神經(jīng)炎，視力損害嚴(yán)重程度不一，一般恢復(fù)較好。但視神經(jīng)脊髓炎相關(guān)視神經(jīng)炎多表現(xiàn)為雙眼同時(shí)或相繼出現(xiàn)的嚴(yán)重的視力損害，視力恢復(fù)較查，可檢測(cè)出視神經(jīng)脊髓炎相關(guān)抗體，如水通道蛋白4抗體(AQP4-Ab)。目前有研究表明BTK/NF-κB信號(hào)通路在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病中可調(diào)控B細(xì)胞分化，可能參與了疾病的發(fā)生[11]。但視神經(jīng)脊髓炎仍缺乏基因分子層面相關(guān)研究，視神經(jīng)炎作為多發(fā)性硬化及視神經(jīng)脊髓炎的典型癥狀，基因及分子層面的研究有助于發(fā)病機(jī)制的闡明，能更好的為兩種疾病的鑒別提供依據(jù)。

多發(fā)性硬化相關(guān)性視神經(jīng)炎不同于視神經(jīng)脊髓炎，多發(fā)性硬化相關(guān)性視神經(jīng)炎多為單眼視力下降，可表現(xiàn)為不同程度的視乳頭水腫或球后視神經(jīng)炎，視力損害嚴(yán)重程度不一，一般恢復(fù)較好。但視神經(jīng)脊髓炎相關(guān)視神經(jīng)炎多表現(xiàn)為雙眼同時(shí)或相繼出現(xiàn)的嚴(yán)重的視力損害，視力恢復(fù)較差，可檢測(cè)出視神經(jīng)脊髓炎相關(guān)抗體，如水通道蛋白4抗體(AQP4-Ab)。目前有研究表明BTK/NF-κB信號(hào)通路在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病中可調(diào)控B細(xì)胞分化，可能參與了疾病的發(fā)生[11]。但視神經(jīng)脊髓炎仍缺乏基因分子層面相關(guān)研究，視神經(jīng)炎作為多發(fā)性硬化及視神經(jīng)脊髓炎的典型癥狀，基因及分子層面的研究有助于發(fā)病機(jī)制的闡明，能更好的為兩種疾病的鑒別提供依據(jù)。

在最新一版修訂版多發(fā)性硬化Mcdonald診斷標(biāo)準(zhǔn)中提出，隨著MS治療選擇增多，精準(zhǔn)診斷顯得格外的重要[12]，應(yīng)結(jié)合影像學(xué)、血清學(xué)、腦脊液及臨床特征與病史來探索疾病的診斷。因此，精準(zhǔn)識(shí)別早期關(guān)鍵的生物學(xué)靶點(diǎn)，通過本研究的基因功能和基因參與的通路富集分析，有助于更加深層次的研究疾病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為快速精準(zhǔn)的診治提供依據(jù)。本研究通過生物信息學(xué)方法，整合數(shù)據(jù)庫資源，應(yīng)用國際互聯(lián)網(wǎng)及計(jì)算機(jī)等信息技術(shù)，將伴有視神經(jīng)炎的多發(fā)性硬化這一復(fù)雜且難診治的疾病的相關(guān)基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析研究，使得神經(jīng)科醫(yī)師以及科研工作者能夠更加深刻的清楚其發(fā)病機(jī)制，為臨床診治帶來了新的希望。