丹參多酚酸通過SIRT1/HMGB1路徑改善大鼠腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究

曹自為， 張 嶸， 李 蒙， 管葉明， 汪青松

目前在全球范圍內(nèi)，卒中現(xiàn)已成為人類死亡的第二大常見病因，而在我國該疾病的致死及致殘率已攀升到了第一位。雖然急診溶栓、介入治療獲得了快速發(fā)展，其能使患者快速恢復(fù)血供，改善缺血所致的腦損傷。但是由于介入治療技術(shù)有較高的要求，急診溶栓的時(shí)間窗較短，并不能得到的廣泛的應(yīng)用，因此，尋找改善缺血性腦損傷的有效藥物，改善腦梗死患者的預(yù)后，具有非常重要的社會(huì)價(jià)值。

丹參作為最古老的中藥之一，最早是用于治療出血性疾病如(月經(jīng)出血)和血瘀方面的疾病，其中最活躍的有效成分之一是丹參多酚酸(包括丹參酮、丹酚酸B等活性成分)[1]。Zeng等[2]的研究驗(yàn)證了丹參多酚酸能通過SIRT1通路抑制HMGB1的表達(dá)，阻斷下游炎癥通路，及其炎癥因子如NF-κB，白細(xì)胞介素(inter-leukin，IL)-1β的表達(dá)，對(duì)高脂肪食物和棕櫚酸誘導(dǎo)的肝脂肪變性和炎癥提供保護(hù)。因此我們推測：丹參多酚酸是否可以通過SIRT1-HMGB1路徑，抑制P-53、NF-κB的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善腦缺血/再灌注損傷。本研究通過腹腔注射丹參多酚酸及SIRT1抑制劑(selisistat，EX-527)至大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠，動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠靜脈血以及腦組織中 SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB的表達(dá)、以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)的改變，探討丹參多酚酸改善大鼠缺血性腦損傷的具體保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇普通級(jí)健康雄性SD大鼠132只，體質(zhì)量250～300 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，均通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理辦法和倫理論證。采用干濕分離飼養(yǎng)籠，自然光照，自由進(jìn)食，7 d后實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(Sham)組、模型(IS)組、丹參多酚酸(SA)組、SIRT1抑制劑EX527(EX527)組，每組 33只。

1.2 鼠大腦中動(dòng)脈梗塞模型建立 Sham組大鼠僅單純分離血管，其余三組采用改良線栓法[3]構(gòu)建大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型。缺血1 h后拔出線栓，術(shù)中及術(shù)后用暖光燈照射大鼠肛門部，保持動(dòng)物體溫 (37±0.5) ℃。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段內(nèi)出現(xiàn)死亡、昏迷及抽搐的大鼠均被棄去。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：從尾部將大鼠提起，保持懸空，轉(zhuǎn)頸超過10°，左前肢屈曲內(nèi)收，同時(shí)伴肌張力下降，活動(dòng)時(shí)呈典型追尾征，若無上述典型癥狀予以剔除。丹參多酚酸(天津天士力子?jì)伤帢I(yè)有限公司)和SIRT1特異性抑制劑EX527溶于5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，丹參多酚酸組分別于手術(shù)前1 h按照100 mg /kg經(jīng)腹腔注入丹參多酚酸，EX527組遵照相同時(shí)間點(diǎn)按5 mg/kg經(jīng)腹腔注入。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modified Neurological Severity Scores，mNSS) 量表[4]分別于再灌注后 1 d、3 d、7 d各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

1.4 RT-PCR檢測梗死灶周邊組織SIRT1、HMGB1mRNA的表達(dá) 取梗死灶周邊缺血腦組織約50～100 mg，剪碎，液氮研磨，在4 ℃環(huán)境下分別加入1 ml TRIzol、氯仿、異丙醇、DEPC水后離心，制備目的細(xì)胞總RNA，置于EP管中，并以該RNA為模板，在適當(dāng)引物的存在下，由反轉(zhuǎn)錄酶生成cDNA。取出cDNA作為熒光定量的模板，經(jīng)歷40次熱循環(huán)，擴(kuò)增后收集熒光信號(hào)，采用相對(duì)量化研究分析數(shù)值。

1.5 Western blot法檢測梗死灶周邊組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB的表達(dá) 取梗死灶周邊腦組織約100 mg左右，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 ml(內(nèi)含1 mmol PMSF)進(jìn)行裂解。4 ℃、12000 r/min離心15 min。收集含有組織總蛋白上清液，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。加入一抗后4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，再洗滌，使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白，以β-actin為內(nèi)參，北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)的分析系統(tǒng)進(jìn)行膠片條帶的分析。

1.6 ELISA法檢測大鼠外周血p-53、NF-κB蛋白含量 各組大鼠分別于1 d、3 d、7 d從大鼠尾靜脈采血約3 ml置于含檸檬酸鈉的抗凝管中，混合10～20 min后，離心20 min左右(2000～3000 轉(zhuǎn)/min)，取上清液。后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)操作溫育、洗滌、染色，最后參考空白孔在450 nm波長下依次測量每個(gè)孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品試劑濃度。

1.7 TUNEL法測定缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù) 假手術(shù)組、模型組、丹參多酚酸組、抑制劑組各取10只大鼠分別于缺血再灌注1 d后取腦組織，制成厚度為2 mm石蠟切片，制作方法同HE染色。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法，根據(jù)羅氏(Roche)公司Tunel試劑盒操作說明進(jìn)行缺血海馬組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測，400倍光鏡下觀察。視野中凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕褐色為凋亡細(xì)胞，呈藍(lán)色為正常神細(xì)胞，每張切片于高倍視野下計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)反映各組缺血區(qū)腦組織凋亡的情況，凋亡指數(shù)=(視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有神經(jīng)元細(xì)胞個(gè)數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分比較 Sham組mNSS評(píng)分在第1 d、3 d、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為0分。與IS組和EX527組比，SA組mNSS評(píng)分明顯降低(F=8.318、9.483、14.596，P<0.01)見表1。

表1 各組不同時(shí)間段神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 Western blot法檢測梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果 再灌注7 d時(shí)，SA組HMGB1、P-53、NF-κB蛋白表達(dá)均顯著低于IS組和EX527組，EX527組HMGB1、P-53、NF-κB蛋白的表達(dá)顯著低于IS組同時(shí)高于Sham組(F=1951.065、2038.176、4717.277，P<0.05)；SA組SIRT1蛋白表達(dá)量顯著高于IS組和EX527組，而EX527組SIRT1蛋白表達(dá)量又顯著高于Sham組和IS組(F=2614.746，P<0.05)，見圖1、圖2。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

圖2 7 d各組梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB蛋白的表達(dá)

2.3 RT-PCR法檢測梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1mRNA含量的結(jié)果 再灌注7 d時(shí)，SA組HMGB1mRNA表達(dá)均顯著低于Sham組、IS組和EX527組，EX527組HMGB1mRNA表達(dá)顯著高于Sham組的同時(shí)低于Sham組(F=199.523，P<0.05)；SA組SIRT1 mRNA表達(dá)量顯著高于Sham組、IS 組 和EX527組，EX527組SIRT1mRNA表達(dá)量顯著高于Sham組和IS組(F=485.729，P<0.05)，見圖3。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

2.4 ELISA法檢測大鼠外周血中P-53、NF-κB蛋白的濃度結(jié)果 再灌注7 d時(shí)，SA組大鼠外周血中P-53、NF-κB蛋白表達(dá)均顯著低于IS組和EX527組，EX527組P-53、NF-κB蛋白的表達(dá)顯著低于IS組同時(shí)高于Sham組(F=2409.562、2329.962，P<0.05)，見圖4。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

2.5 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 采用TUNEL法檢測在400倍光鏡加下觀測到大鼠腦組組織再灌注1 d后，IS組神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯提高(P<0.05)。SA組神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于IS組和EX527組(P<0.05)。EX527組凋亡指數(shù)要低于IS組(P<0.05)，見圖5。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

3 討 論

以往的一系列的研究表明SIRT1在缺血性腦損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用[5]。神經(jīng)炎癥是一種在缺血后立即開始的破壞性反應(yīng)[6]。促炎介質(zhì)的主要轉(zhuǎn)錄因子是NF-κB，已有研究小組證實(shí)NF-κB的激活加劇了腦缺血后的神經(jīng)損傷[7]。SIRT1使其p65亞基L以上Lys310的NF-κB脫乙酰化，降低其轉(zhuǎn)錄活性[8]。本實(shí)驗(yàn)中我們主要發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SIRT1蛋白的丹參多酚酸組其炎癥因子P-53、NF-κB的表達(dá)要明顯低于低表達(dá)SIRT1蛋白的模型組。但是抑制劑組在丹參多酚酸組的基礎(chǔ)上使用了SIRT1通路特異性阻斷劑EX-527后，其P-53、NF-κB的表達(dá)又出現(xiàn)較丹參多酚酸組升高的現(xiàn)象。說明SIRT1通路確實(shí)發(fā)揮了抑制炎癥反應(yīng)的作用，與以往研究結(jié)論相符，而關(guān)于SIRT1在促進(jìn)神經(jīng)、基因修復(fù)；改善血流方面的作用未做進(jìn)一步研究。

根據(jù)目前的研究，HMGB1 廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中。細(xì)胞外，HMGB1 主要來源于細(xì)胞的主動(dòng)和被動(dòng)釋放，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在受制于HMGB1，可被凋亡細(xì)胞、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子或白介素等刺激后主動(dòng)分泌。另外，細(xì)胞壞死及凋亡時(shí)可被動(dòng)釋放HMGB-1/核小體復(fù)合物[9]。

胞外HMGB1與晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycationend products，RAGE)結(jié)合，磷酸化絲裂原活化蛋白激酶，如p38 激酶、SAPK/TNK、ERK1 /2 等。通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活NF-κB通路，例如細(xì)胞分裂周期蛋白42、鳥苷三磷酸激酶、Janus 激酶。誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)并參與免疫細(xì)胞遷移和表面受體表達(dá)[10～12]。HMGB-1與TLR2、TLR4結(jié)合激活 MyD88 依賴性 NF-κB 通路，促進(jìn) TNF、IL-1、IL-6等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和釋放[13，14]。HMGB1作為炎癥介質(zhì)廣泛存在于所有細(xì)胞中，通過與RAGE和toll樣受體(toll-like receptors，TLR)2，TLR4和TLR9受體相互作用[15～17]，激活免疫活性細(xì)胞，對(duì)炎癥反應(yīng)具有級(jí)聯(lián)放大作用。本實(shí)驗(yàn)中，模型組1 d、3 d、7 d缺血腦組織中HMGB1蛋白或是mRNA的表達(dá)都較假手術(shù)組明顯提高。以上說明腦缺血后，HMGB1早期釋放，并促進(jìn)了炎癥的進(jìn)展。如何減輕炎性因子導(dǎo)致的“瀑 布 效 應(yīng)”是挽救腦缺血缺血/再灌注所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵點(diǎn)。

丹參多酚酸同時(shí)具有改善微循環(huán)、抗炎、抗栓、抗氧化、清除自 由基、抑制內(nèi)皮素釋放、改善器官缺血再灌注損傷等作用，藥理學(xué)機(jī)制的特點(diǎn)是在分子和細(xì)胞水平上有多個(gè)連接和多個(gè)靶點(diǎn)[17]，從我們的研究結(jié)果來看，丹參多酚酸組無論是缺血腦組織周邊SIRT1蛋白還是SIRT1 mRNA的表達(dá)從第一天開始就明顯較模型組和抑制劑組增加。同時(shí)丹參多酚酸組缺血腦組織周邊HMGB1、P-53、NF-κB蛋白和HMGB1、P-53、NF-κB mRNA的表達(dá)明顯較模型組和抑制劑組降低。抑制劑組使用了SIRT1特異性抑制劑EX-527后，無論是缺血腦組織周邊SIRT1蛋白還是SIRT1 mRNA的表達(dá)要高于模型組和假手術(shù)組，這可能是EX-527不完全阻斷丹參多酚酸的對(duì)SIRT1的激動(dòng)作用有關(guān)，因此，抑制劑組缺血腦組織周邊HMGB1、P-53、NF-κB蛋白和HMGB1、P-53、NF-κB mRNA的表達(dá)在高于丹參多酚酸組的同時(shí)也要低于模型組。

以上結(jié)果說明丹參多酚酸可以通過促進(jìn)SIRT1轉(zhuǎn)錄、抑制HMGB1遷移和表達(dá)，減少下游通路的炎癥因子P-53、NF-κB的釋放，同時(shí)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠大腦缺血/再灌注損傷。