升降散加減方治療IgAN大鼠作用機(jī)制探討

張圓圓 靳培培 郭登洲

IgA腎病(immunoglobulin a nephropathy，IgAN)是指以IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)，臨床表現(xiàn)以血尿，伴或不伴蛋白尿?yàn)橹鞯牟±砭C合征[1]。IgAN治療方面，西醫(yī)多以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑控制血壓、減少尿蛋白，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療為主，而傳統(tǒng)中醫(yī)雖對(duì)IgAN沒(méi)有明確的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“尿血”“腰痛”“水腫”“虛勞”等疾病的范疇，以其獨(dú)特的理論作指導(dǎo)來(lái)辨證論治本病，如《血證論·尿血》中提到“膀胱與血室并域而居，熱入血室則蓄血，熱結(jié)膀胱則尿血，尿乃水分之病，而亦干動(dòng)血分者，以與血室并居，故相連累也”?？梢?jiàn)濕熱常見(jiàn)于IgAN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察疏通三焦、清熱利濕理論指導(dǎo)的升降散加減方對(duì)IgAN大鼠24小時(shí)尿蛋白定量(24 hours urinary total protein，24h-UTP)，血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清白蛋白(albumin，ALB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、半乳糖缺乏的IgA(galactose deficient IgA，Gd-IgA)表達(dá)水平的影響以及IgAN大鼠腎臟組織病理的變化，來(lái)了解升降散加減方可能的作用機(jī)制，為臨床治療本病提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥物

于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)進(jìn)48只雄性SD大鼠，健康清潔級(jí)，體重(150±10)g，動(dòng)物合格證編號(hào)：1805044，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

升降散加減方組成：僵蠶15 g、蟬蛻15 g、杏仁12 g、陳皮12 g、茯苓15 g、炒萊菔子12 g、黃芪15 g，購(gòu)自河北省中醫(yī)院中藥房，以上藥物先經(jīng)蒸餾水浸泡2小時(shí)，煎煮2次(40分鐘/次)后，過(guò)濾，合并濾液加熱蒸發(fā)，依據(jù)陳奇大鼠與人藥物劑量折算方法再分別濃縮至含生藥1 g/mL水提液，制成藥液備用，每次根據(jù)老鼠體重灌服。鹽酸貝那普利片由北京諾華制藥有限公司提供。

1.2 試劑與部分儀器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；四氯化碳(CCl4),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蓖麻油，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

尿液分析儀(美國(guó)CLINITEK50)(全自動(dòng)洗板機(jī)8×12，美國(guó))、全自動(dòng)生化分析儀(Japan，Sysmex HEMIX-180)、離心機(jī)(上海安亭，TDL-5-A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX96)、酶標(biāo)儀(Thomer Fisher MK FC)、電熱恒溫水箱(600型，天津泰斯特)等。

1.3 造模與分組給藥

將SD大鼠隨機(jī)分為正常組12只、造模組36只，進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，采用聯(lián)合BSA灌胃+尾靜脈注射LPS+皮下注射CCl4、蓖麻油的免疫復(fù)合的方法建立實(shí)驗(yàn)性IgAN模型，方案如下：口服免疫原BSA劑量較常用劑量增加1倍，以600 mg/kg隔天灌胃，持續(xù)6周；CCl4注射方式由既往的腹腔注射改為皮下注射，皮下注射蓖麻油0.5 mL+CCl40.10 mL，每周1次，持續(xù)9周，并聯(lián)合運(yùn)用LPS，分別于第6、8周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。模型制作成功后，將造模組大鼠隨機(jī)分成中藥組、西藥組和模型組各12只。中藥組每日灌服中藥，西藥組每日灌服1.8 mg/kg鹽酸貝那普利，模型組、正常組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，共8周。

1.4 采集標(biāo)本與檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 24h-UTP檢測(cè) 分別于實(shí)驗(yàn)第1、9、15、19周留取24小時(shí)尿液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，并記錄好相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)19周后，禁食12小時(shí)，禁水4小時(shí)，腹腔注射麻醉后(10%水合氯醛3.5 mL/kg)，采用股動(dòng)脈采血，運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定Scr、BUN、ALB等指標(biāo)；運(yùn)用ELISA法檢測(cè)血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量。

1.4.3 腎組織鏡檢及免疫熒光檢查 大鼠股動(dòng)脈取血后，立即將大鼠腎臟分離，將切取的腎組織用4%的多聚甲醛液進(jìn)行固定，用于蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、馬松染色(Masson staining，Masson)、過(guò)碘酸雪夫氏染色(schiff periodic scid shiff，PAS)、過(guò)碘酸—銀—烏洛托品(Perioddic acid silver meth enamine，PASM)常規(guī)染色的光鏡制備使用；將一部分腎臟組織迅速制成冰凍切片，用于進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)；取大小為1 mm×1 mm的腎組織于4%的戊二醛固定液中用以進(jìn)行透射電鏡樣本制備。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

正常組大鼠毛色光亮，精神、攝食、飲水均正常，體重逐漸增加；模型組、中藥組、西藥組大鼠在造模階段出現(xiàn)毛色亮度降低，精神不振，進(jìn)食減少，體重增加緩慢；而藥物干預(yù)治療后，中藥組、西藥組大鼠上述癥狀有所恢復(fù)。

2.2 各組大鼠24h-UTP檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第1周，各組實(shí)驗(yàn)大鼠尿蛋白均為陰性，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第9周，與正常組相比，模型組、中藥組、西藥組實(shí)驗(yàn)大鼠24h-UTP均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第15、19周，與正常組相比，模型組實(shí)驗(yàn)大鼠24h-UTP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、西藥組實(shí)驗(yàn)大鼠24h-UTP均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與西藥組相比，中藥組大鼠24h-UTP 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組IgAN大鼠24h-UTP的變化比較

2.3 各組大鼠血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與正常組相比，各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組相比，中藥組、西藥組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與西藥組比較，中藥組實(shí)驗(yàn)大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組IgAN大鼠血清Scr、BUN和ALB的比較

2.4 光鏡觀察各組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)

正常組大鼠腎小球等形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常，基底膜、系膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及胞外基質(zhì)未見(jiàn)異常病理改變，無(wú)間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管腔清晰；模型組大鼠腎小球呈代償擴(kuò)張和萎縮病變，系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈中重度增生，系膜基質(zhì)表現(xiàn)為彌漫性增寬增厚，腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈間質(zhì)纖維化，毛細(xì)血管袢阻塞；西醫(yī)組、中藥組大鼠光鏡下腎組織病理改變與模型組相似，但較模型組病理?yè)p傷較輕。見(jiàn)圖1～4。

2.5 電鏡觀察各組大鼠腎臟系膜區(qū)

正常組大鼠腎小球系膜區(qū)清晰，無(wú)電子致密物，基質(zhì)分布均勻，足突排列有序，大小相等，基底膜厚度一致；模型組系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，系膜區(qū)散在高密度電子致密物沉積，足細(xì)胞可見(jiàn)足突節(jié)段性融合、絨毛變性；西藥組、中藥組大鼠電鏡下見(jiàn)少量電子致密物沉積系膜區(qū)，足突輕度融合或不明顯，腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，西藥組、中藥組大鼠電鏡下病理?yè)p傷較模型組有所減輕。見(jiàn)圖5。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

2.6 免疫熒光法觀察各組大鼠腎臟腎小球系膜區(qū)

正常組大鼠無(wú)免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)；模型組大鼠有團(tuán)塊狀免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)；西藥組、中藥組大鼠有不同程度的免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)，但沉積量較模型組少。見(jiàn)圖6。

2.7 ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量

與正常組相比，模型組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、中藥組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組IgAN大鼠血清中TGF-β1、IL-6 和Gd-IgA的比較

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)選擇依據(jù)

IgAN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而免疫致病機(jī)制為本病的重要致病機(jī)制。IgAN的首要發(fā)病機(jī)制為IgA1異常糖基化[2]。IgA1分子正常的情況下有獨(dú)特的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)，在鉸鏈區(qū)中有多個(gè)蘇氨酸、絲氨酸殘基，此為O糖基化的連接位，IgA1分子O糖基化過(guò)程中，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)在N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的作用下與絲氨酸、蘇氨酸連接形成O糖基化的基本結(jié)構(gòu)，半乳糖(Gal)在C1GalT1和分子伴侶Cosmc的催化作用下與GalNAc連接，N-乙酰神經(jīng)氨酸在α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GALNAC2)或α-2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3GAL)的作用下與GalNAc或Gal連接形成糖鏈[3]。而在產(chǎn)生IgA1的細(xì)胞中，GalNAc的唾液酸僅由ST6GALNAC2催化。IgA1分子的O-連接聚糖形成過(guò)程中，若IgA1分子鉸鏈區(qū)O -糖基化程度降低，缺乏半乳糖的GalNAc上直接連接唾液酸，此時(shí)形成的多聚糖無(wú)法被修飾則產(chǎn)生了Gd-IgA1，而Gd-IgA1與IgAN的發(fā)生相關(guān)[4]。Gd-IgA1可使IgA1易于自身聚集，或形成免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)，此為IgA的主要發(fā)病原因[5]。Robert等[6]認(rèn)為只要影響到糖基化的酶，就可能影響IgA1糖基化，C1GalT1、ST6GALNAC2即為上述過(guò)程中的關(guān)鍵酶。影響這2種酶表達(dá)或活性的因素，即能使 C1GalT1活性低并且(或者)使ST6GALNAC2活性增強(qiáng)就會(huì)使IgA1異常糖基化。最新研究發(fā)現(xiàn)， TGF-β通過(guò)下調(diào)C1GalT1和Cosmc的 mRNA水平來(lái)影響二者的產(chǎn)生[7]。IL-6在IgAN 患者的血清中含量升高，會(huì)降低Cosmc和C1GalT1的表達(dá)，進(jìn)而影響IgA1的糖基化[8-9]。此外，IL-6還能增加ST6GalNAcⅡ 的表達(dá)。

3.2 疏通三焦，清熱利濕理論依據(jù)

IgA腎病在中醫(yī)上屬于“水腫”“血尿”等范疇，根據(jù)陳香美等[10]制作的大樣本IgAN患者中醫(yī)證候的流行病學(xué)調(diào)查顯示IgAN患者主要以“濕熱”“血瘀”兩種證候?yàn)橹?31.6%、28.9%)。時(shí)振聲教授[11]也認(rèn)為濕熱是導(dǎo)致腎病發(fā)生的主要病因病機(jī)。人體水液代謝與肺、脾、腎、三焦關(guān)系密切，肺主通調(diào)水道；脾主運(yùn)化水液；腎主水，調(diào)節(jié)體內(nèi)水液的潴流、分布、排泄，三焦是水液運(yùn)行的通道，其中脾居中焦，主運(yùn)化水液，是水液代謝的樞紐。當(dāng)各種病理因素，如七情內(nèi)傷等致使脾的運(yùn)化受損，則會(huì)引起水液停聚為濕邪，此時(shí)若機(jī)體正氣虧虛感受外邪則會(huì)化生濕熱。濕為陰邪，其性重濁黏滯，易襲陰位，故而侵犯下焦，腎為五臟之下極，故最易受之。此外，濕邪日久亦可化熱，而濕熱可循水液運(yùn)行三焦，引起肺、脾、腎三臟功能失調(diào):濕熱壅塞上焦，則肺失宣發(fā)肅降，氣化失司，故見(jiàn)肢體水腫；濕熱壅塞中焦，脾失健運(yùn)，中焦運(yùn)化水液失司，引起惡性循環(huán)，加重濕熱；濕熱壅塞下焦，腎失封藏，五臟六腑所藏之精不固而下泄，故可見(jiàn)蛋白尿，濕熱蘊(yùn)結(jié)于膀胱，灼傷脈絡(luò)可見(jiàn)血尿。

郭登洲教授結(jié)合多年臨床治療經(jīng)驗(yàn)及目前研究共識(shí)，認(rèn)為濕熱為本病的重要病因[12-14]，而“血瘀”貫穿于IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展整個(gè)過(guò)程中。其病機(jī)為脾胃虛弱導(dǎo)致水液運(yùn)化失司，水液停聚，日久化熱，從而影響脾胃的正常運(yùn)化，致使?jié)駸岣鼊?；濕熱下注，累及下焦，水熱互結(jié)，損傷腎臟，使血溢出脈外，出現(xiàn)血尿，日久致使腎臟出現(xiàn)病理變化；同時(shí)濕熱日久，耗傷陰液，陰虧血耗，則血行遲緩，瘀血內(nèi)生；“濕熱”“血瘀”兩者相互影響，共同促進(jìn)疾病的發(fā)展，加重腎臟組織的損傷。因此筆者團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“濕熱內(nèi)蘊(yùn)，瘀血阻絡(luò)”是IgAN基本證候。因此治療上當(dāng)以疏通三焦，清熱利濕為原則，方用升降散加減方使三焦通暢，濕熱得以清利，從而使疾病得到有效控制以期達(dá)到治愈。

3.3 升降散加減方用藥分析

升降散加減方由僵蠶、蟬蛻、杏仁、陳皮、茯苓、炒萊菔子、黃芪組成。其中僵蠶氣輕味浮，可祛風(fēng)散結(jié)，宣發(fā)氣機(jī)，開(kāi)其濕熱郁結(jié)；僵蠶、蟬蛻，生發(fā)清陽(yáng)以宣發(fā)諸身氣機(jī)，使郁結(jié)得開(kāi)，氣機(jī)暢達(dá)；杏仁開(kāi)上焦肺氣，肺宣濕開(kāi)，則熱隨濕去；以陳皮通調(diào)中焦氣機(jī)，使氣機(jī)調(diào)達(dá)，給濕邪以去處；茯苓、炒萊菔子利濕通腑導(dǎo)下焦?jié)駸?，使下焦通暢；黃芪補(bǔ)氣之不足，諸藥合用疏利三焦、清利濕熱。氣充則化濕利水，正氣足而邪不可干。課題組運(yùn)用升降散加減方治療IgAN，對(duì)于減輕血尿、蛋白尿確有實(shí)效，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了前期臨床觀察，結(jié)果表明升降散加減方有助于減低終點(diǎn)事件的發(fā)生，減少血尿、蛋白尿，治療IgAN療效確切[15]，這也進(jìn)一步證明了濕熱在IgAN發(fā)病過(guò)程中起重要作用。

綜上，疏通三焦、清熱利濕理論指導(dǎo)下的升降散加減方可減輕IgAN大鼠腎臟的病理變化，其降低尿中蛋白及減輕腎臟病理變化的效果與貝那普利相當(dāng)?？梢?jiàn)本方對(duì)IgAN大鼠有治療作用，其作用機(jī)制可能與降低血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量有關(guān)。