薇菜酸性多糖的分離純化及成分分析

胡彥波，劉 揚(yáng)，趙偲如，趙 珺

(長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130022)

薇菜(Osmundajaponica)屬紫萁科紫萁屬分株紫萁，學(xué)名桂皮紫萁，是長白山地區(qū)野生山野菜之一，富含多糖、蛋白質(zhì)和微量元素等，具有提高免疫力、抗菌和抗病毒等功效[1-2]。因其獨(dú)特的生物活性，目前薇菜被譽(yù)為“山菜之王”[3]。薇菜多糖是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大分子化合物[4]，研究表明，薇菜多糖具有抗氧化、抗腫瘤和抑菌等多種功能，此外，薇菜多糖對機(jī)體的生長發(fā)育和代謝起著重要的作用[5-7]。由于薇菜多糖以水溶性多糖為主，目前關(guān)于薇菜多糖的提取方法多采用水提醇沉法，還有微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等輔助提取技術(shù)[8-10]。雖然微波輔助提取法和超聲波輔助提取法可在一定程度上增加薇菜多糖得率，但對薇菜多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)是否存在影響尚未進(jìn)行深入研究。此外，部分科研人員對薇菜進(jìn)行了初步的分離純化。例如，李磊等[11]采用離子交換柱層析法對薇菜多糖進(jìn)行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薇菜多糖主要以酸性多糖為主?？颅?cè)A等[12]利用Sevage法和Sephadex G-200柱層析法對薇菜多糖進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步通過紅外光譜和高效液相色譜(HPLC)分析，得到薇菜多糖的單糖組成為木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖以及三種未知成分。由于薇菜多糖的分離純化技術(shù)和結(jié)構(gòu)分析程度有限，針對薇菜多糖的生物活性研究極少[13]。目前，薇菜作為大宗山野菜，遠(yuǎn)銷日本和韓國等多個(gè)國家，但由于缺乏對薇菜多糖系統(tǒng)的分離純化和結(jié)構(gòu)分析，其深入研究尚未進(jìn)行，限制了薇菜的開發(fā)與應(yīng)用。因此，通過對薇菜多糖進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化，并對其純化后的組分進(jìn)行分析和鑒定，為薇菜多糖的深入研究及相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供了參考依據(jù)，并推動(dòng)了長白山地區(qū)野生資源的精深加工。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：薇菜，購于吉林省長白山露水河鎮(zhèn)林區(qū)。

供試試劑：苯酚、硫酸(分析純)，北京化工廠有限責(zé)任公司；Sepharose CL-6B，上海索寶生物科技有限公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國天地TEDIA；KBr(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；NaCl(色譜純)，上海麥克林生化科技有限公司；TFA(sigma標(biāo)準(zhǔn)品)、DEAE-纖維素柱，上海源葉生物科技有限公司。

供試儀器：BM312-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；3K15臺式高速離心機(jī)，上海亞榮生化儀器廠；LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津公司；Nicolet is 5傅里葉紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；RID-10A示差檢測器，日本島津公司；TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱，賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薇菜酸性多糖制備 采用水提醇沉法提取薇菜總多糖。稱取新鮮薇菜4 kg，切成1 cm小段，在料液比為1∶20 g·mL-1、提取時(shí)間為4 h的條件下提取薇菜總多糖。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將薇菜總多糖溶液濃縮至原體積的1/3，70%乙醇過夜醇沉后4 000 rpm·min-1離心20 min棄去上清液得到沉淀，即為薇菜總多糖WOJP。進(jìn)一步在60 ℃水浴下攪拌烘干，除去乙醇，加蒸餾水溶解，冷凍干燥。然后用DEAE-纖維素對WOJP分離純化，蒸餾水洗脫制備薇菜中性多糖WOJP-N，0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脫制備薇菜酸性多糖WOJP-A。

1.2.2 薇菜酸性多糖的分離純化 稱取WOJP-A 100 mg，溶于2 mL的蒸餾水中，離心去除沉淀，將上清液上樣于平衡好的Sepharose CL-6B凝膠色譜柱，0.15 mol·L-1NaCl洗脫液，流速0.15 mL·min-1，每管收集液體體積3 mL。利用苯酚-硫酸法[14]于490 nm處測定收集液的吸光度，繪制洗脫曲線，根據(jù)WOJP-A的洗脫曲線，收集合適的洗脫峰，透析濃縮凍干，獲得分子量均一組分。WOJP提取和分離純化的技術(shù)路線如圖1所示。根據(jù)薇菜多糖的電荷和分子量的不同可選擇不同的分離純化方式。使用DEAE-纖維素柱層析經(jīng)過0.2 mol·L-1NaCl洗脫獲得電荷均一組分的WOJP-A，進(jìn)一步使用Sepharose CL-6B分離純化獲得分子量不同的四個(gè)多糖組分。

1.2.3 薇菜酸性多糖的分子量分布測定 稱取1 mg薇菜酸性多糖的不同組分樣品，溶解于200 μL超純水(ddH2O)中，采用高效液相系統(tǒng)，RID-10A示差檢測器及TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱對分離純化的多糖分子量分布均一性測定，流速0.6 mL·min-1，流動(dòng)相為0.2 mol·L-1NaCl水溶液，柱溫35 ℃檢測[15]。

1.2.4 薇菜酸性多糖的單糖組成測定 稱取1 mg薇菜酸性多糖待測樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL 2 mol·L-1鹽酸甲醇溶液，充N2密封，置于80 ℃金屬浴中水解10 h后空氣泵吹干，再加入1 mL 2 mol·L-1三氟乙酸(TFA)，置于金屬浴中120 ℃水解1 h，用空氣泵吹干除去TFA。分別取濃度為1 mg·mL-1的甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各100 μL混合，置于酸水解小瓶中吹干。然后將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PMP柱前衍生化和HPLC檢測分析單糖組成[16-17]。

1.2.5 薇菜酸性多糖的紅外光譜分析 取充分干燥的薇菜酸性多糖粉末樣品1 mg，與180 mg溴化鉀(KBr)一起研磨后制成透明壓片，使用傅里葉紅外光譜儀于4 000～500 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描分析，得到紅外光譜曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 薇菜酸性多糖的分離純化

采用烘干的方式測定薇菜含水量為92.4%，即薇菜干物質(zhì)質(zhì)量為7.6%。將薇菜按照干物質(zhì)質(zhì)量和蒸餾水比例為1∶20 g·mL-1進(jìn)行熱水煮提，進(jìn)一步采用70%乙醇醇沉制備薇菜總多糖WOJP。提取后根據(jù)是否帶電荷利用DEAE-纖維素柱層析將WOJP分離純化，制備不含電荷的中性多糖WOJP-N和帶電荷的酸性多糖WOJP-A。根據(jù)WOJP-A分子量分布不同，利用Sepharose CL-6B對WOJP-A分離純化。利用苯酚-硫酸測定洗脫液的吸光值，繪制洗脫曲線如圖2所示，經(jīng)過Sepharose CL-6B分離純化后，WOJP-A分成4個(gè)組分。分別將4個(gè)多糖組分濃縮、透析和凍干，進(jìn)一步稱量質(zhì)量，其中WOJP-A-b和WOJP-A-c為主要組分，其得率分別為24.6%和27.6%。

2.2 高效液相凝膠排阻色譜分析薇菜酸性多糖各組分的分子量分布

利用TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱對分離純化的WOJP-A-b和WOJP-A-c分子量分布情況進(jìn)行測定。WOJP-A-b的色譜結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，WOJP-A-b的洗脫峰呈均勻?qū)ΨQ分布，說明其分子量相對均一，是薇菜多糖的一種均一組分。經(jīng)計(jì)算，WOJP-A-b分子量的大小為10.6 kDa，說明WOJP-A-b是含有幾十個(gè)單糖的均一多糖組分。

WOJP-A-c的色譜結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，WOJP-A-c的洗脫峰與WOJP-A-b的形狀相似，也呈均勻?qū)ΨQ分布，說明其分子量相對均一。經(jīng)計(jì)算，WOJP-A-c分子量的大小為4.5 kDa，說明WOJP-A-c是含有10～20個(gè)單糖組成的均一寡糖組分。

2.3 高效液相色譜法分析薇菜酸性多糖的單糖組成

進(jìn)一步通過高效液相色譜法測定WOJP-A以及分離純化后的均一組分WOJP-A-b和WOJP-A-c的單糖組成。經(jīng)過計(jì)算各組分的單糖摩爾比，如表1所示。由表1可知，三種多糖均含有Rha、GalA、Gal和Ara四種單糖，此外還含有少量Glc和Xyl。但三者在單糖含量上存在很大差異。WOJP-A主要單糖的摩爾比為Rha∶GalA∶Gal∶Ara=7.0∶56.4∶26.1∶5.2；分離純化后的WOJP-A-b主要單糖的摩爾比為Rha∶GalA∶Gal∶Ara=3.7∶68.3∶12.5∶9.0；WOJP-A-c主要單糖的摩爾比為Rha∶GalA∶Gal∶Ara=6.8∶39.4∶41.2∶11.8。綜上，WOJP-A和WOJP-A-b單糖組成較為相似，主要由GalA組成，推測其可能主要由半乳糖醛酸聚糖組成；WOJP-A-c則主要由Gal和GalA組成，推測其可能由部分半乳糖醛酸寡糖和半乳寡糖組成。

表1 薇菜酸性多糖各組分的單糖組成及分析

2.4 紅外光譜分析薇菜酸性多糖各組分的特征官能團(tuán)

利用紅外光譜對分離純后的WOJP-A-b和WOJP-A-c含有的特征官能團(tuán)進(jìn)行測定，并參考Feng等[18]進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5～6所示。由圖5～6可知，WOJP-A-b和WOJP-A-c的光譜圖含有的特征吸收峰大致相同，分別為3 400 cm-1左右的-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2 920 cm-1左右的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，這兩個(gè)吸收峰是多糖的特征吸收峰。同時(shí)，在兩個(gè)多糖的光譜中可以看到1 740 cm-1和1 610 cm-1左右的特征吸收峰。分析其為C=O的伸縮振動(dòng)及C=O的非對稱伸縮振動(dòng)吸收峰，說明這兩個(gè)多糖中可能含有-COOH，是一種含有一定酯化程度的酸性多糖。但比較二者紅外光譜中吸收峰的相對高度不同，說明二者含有的酸性糖以及酯化的酸性糖是不同的。此外，還可以觀察到1 100 cm-1和1 020 cm-1附近的吸收峰，為酯羰基(C-O-C)伸縮振動(dòng)和C-O-H連接所致，是吡喃環(huán)的特征吸收峰，說明兩種多糖均含有吡喃糖環(huán)。與WOJP-A-c不同，WOJP-A-b在838.63 cm-1附近存在一個(gè)特征吸收峰，其為α-糖苷鍵的特征吸收峰，說明WOJP-A-b含有α-糖苷鍵，其結(jié)果與單糖組成分析的推測結(jié)果相吻合。

3 結(jié) 論

本研究利用Sepharose CL-6B對薇菜酸性多糖WOJP-A分離純化，成功制備了兩個(gè)均一組分WOJP-A-b(24.6%)和WOJP-A-c(27.6%)，其分子量分別為10.6 kDa和4.5 kDa。單糖組成表明，WOJP-A、WOJP-A-b和WOJP-A-c三種多糖的單糖組成相似，但含量明顯不同。其中WOJP-A和WOJP-A-b主要由GalA組成，推測其可能主要由半乳糖醛酸聚糖組成；WOJP-A-c則主要由Gal和GalA組成，推測其可能由部分半乳糖醛酸寡糖和半乳寡糖組成。紅外光譜分析結(jié)果表明，WOJP-A-b和WOJP-A-c含有的-OH、-CH和-COOH等多種特征吸收峰大致相同，說明二者含有多糖的特征官能團(tuán)基本一致。本研究為薇菜多糖的深入研究和相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供參考依據(jù)，并推動(dòng)了長白山地區(qū)野生資源的精深加工。