紀(jì) 敏 ,林柏良 ,鄧生菊 ,彭健波 ,杜 瑋 ,于美玲,王冬英 ,何家康 ,2
(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004;2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心,南寧 530003;3.廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司,南寧 530003)
動(dòng)物膽膏是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材,具有良好的清肝明目、通便解毒、止咳平喘等功效,毒副作用較小,資源豐富且價(jià)格低廉[1-3]。國內(nèi)許多人用中成藥、獸用中成藥以膽膏與其他中藥配制動(dòng)物膽膏,對(duì)風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、熱痢、糞便燥結(jié)等各種熱性病有較好的療效[4-6]。大量研究表明,動(dòng)物膽膏的主要化學(xué)成分為膽汁酸類,包括水溶性結(jié)合型膽酸和脂溶性游離型膽酸[7]。膽汁酸主要包括膽酸、鵝去氧膽酸以及豬去氧膽酸等,這幾種膽汁酸都具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景,主要存在于畜、禽膽膏中,一般都以天然提取方式得到[8,9]。傳統(tǒng)上中國曾采用乙醇提取法,但此法提取過程較單一,需要多次重復(fù)水解、提取、結(jié)晶等處理步驟,而且需要使用大量的易燃易爆有機(jī)溶劑,且乙醇回收率低,生產(chǎn)周期較長(zhǎng),經(jīng)濟(jì)效益不高。還有采用酸沉淀法[10]和鹽析法[11]提取粗膽汁酸,也存在提取工藝繁瑣、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等工藝缺陷。為了綜合開發(fā)利用動(dòng)物膽膏,廉價(jià)高效地得到這幾種膽汁酸,使其更好地發(fā)揮藥用價(jià)值和功效,本研究以豬膽膏為試驗(yàn)原料,經(jīng)單因素篩選后選取1∶1鹽酸用量、NaOH用量和純化時(shí)間為考察因素,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化膽膏中膽汁酸的提取工藝,以期建立工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無污染、高含量、高收率的生產(chǎn)工藝,最終符合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
豬膽膏(批號(hào)為20171002),購自泰安廣鑫生物科技有限公司;豬去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)為100087-201610)、鵝去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)為 110806-201606),均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙酸均為色譜純,乙酸乙酯、鹽酸均為國產(chǎn)分析純,購自美國Fisher公司。
高效液相色譜儀(LC-20A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(SIL-20A),均購自日本島津制作所;電子分析天平(BP211D),購自德國賽多利斯集團(tuán);超聲波儀(B3200S-T),購自必能信超聲上海有限公司;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Alltech ELSD 3300),購自美國格雷斯奧泰公司;Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm,5 μm),購自北京金歐亞科技發(fā)展有限公司;雷磁酸度計(jì),購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
1.3.1 酸堿純化提取法工藝流程 以10 g膽膏為原料,將膽膏敲碎,加入適量去離子水加熱攪拌使之完全溶解,冷卻,加入適量1∶1鹽酸,攪拌均勻,靜置純化一定時(shí)間,過濾取沉淀,加入適量去離子水,加入適量固體氫氧化鈉,溶解完全后,板框4層濾紙過濾,即得膽膏純化液。
1.3.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 經(jīng)單因素篩選后,選擇1∶1鹽酸用量、NaOH用量、純化時(shí)間3個(gè)因素,每個(gè)因素分3個(gè)水平,因素水平如表1所示。精密稱取9份膽膏,每份10 g,根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行純化提取、過濾,加去離子水定容至100mL,測(cè)定膽膏純化液中鵝去氧膽酸和豬去氧膽酸的含量。
表1 正交試驗(yàn)因素與水平
1.3.3 膽膏的含量測(cè)定
1)色譜條件。Waters Symmetry C18色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相為0.1%冰乙酸∶乙腈=50∶50;流速為1 mL/min;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;進(jìn)樣量為對(duì)照品溶液 5、10 μL,供試品溶液 10 μL;理論板數(shù)按豬去氧膽酸峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000。
2)對(duì)照品溶液的制備。取豬去氧膽酸對(duì)照品和鵝去氧膽酸對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸0.625 mg的溶液,備用。
3)供試品溶液的制備。精密量取本品續(xù)濾液10 mL,置于50 mL錐形瓶中,加NaOH溶液10 mL,用牛皮紙將瓶口密封,置于立式滅菌鍋中,120℃,103 kPa,加熱 4 h,冷卻至室溫,用 HCl調(diào)節(jié) pH至6~7,移至100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,過濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍試驗(yàn) 分別精密量取豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液 2、3、4、5、10 mL至10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,即可。按“1.3.3”色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè),以豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品濃度(mg/mL)的對(duì)數(shù)x為橫坐標(biāo),峰面積的對(duì)數(shù)y為縱坐標(biāo),分別繪制豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液各 10 μL,按“1.3.3”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄各峰面積,計(jì)算方法的精密度。
1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取樣品6份,按“1.3.3”方法制得供試品溶液,并進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)。
1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取樣品,按“1.3.3”方法制得供試品溶液,分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 后,進(jìn)行含量檢測(cè),考察供試品溶液的穩(wěn)定性。
1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的膽膏純化液10 mL,置于100 mL容量瓶中,加去離子水稀釋至刻度線,精密量取5 mL,每份加入豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液各2.5 mL,平行6份,混勻后按“1.3.3”方法制得供試品溶液,并進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的回收率。
將膽膏敲碎,精密稱取膽膏10 g,加入適量去離子水溶解并加熱煮沸后制得膽膏水溶液,冷卻后加入5倍95%乙醇,攪拌過夜,過濾,收集濾液。回收乙醇后制得濃膽膏液,再加入5倍95%乙醇,攪拌過夜,過濾,收集濾液,回收乙醇后制得膽膏純化液。加去離子水定容至100 mL。測(cè)定膽膏純化液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。
取同一批次膽膏提取物,精密稱取6份,每份10 g,分別按乙醇純化工藝和酸堿純化工藝最佳條件純化,純化液按同樣方法處理,分別測(cè)得總膽酸含量。采用SPSS 21.0軟件,以t檢驗(yàn)比較2種提取工藝測(cè)量結(jié)果間的差異。
采用正交試驗(yàn)分別測(cè)得9次試驗(yàn)樣品中鵝去氧膽酸和豬去氧膽酸的含量,結(jié)果見表2。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。
表2 酸堿純化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果
對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析,由極差R分析可知,影響最佳提取工藝的因素順序?yàn)锽>A>C,即NaOH用量>1∶1鹽酸用量>純化時(shí)間,初步確定最佳提取工藝組合為A1B2C3。由表3方差分析可知,1∶1鹽酸用量(A)與 NaOH 用量(B)對(duì)總膽酸含量測(cè)定有顯著的影響(P<0.05),純化時(shí)間(C)與總膽酸含量測(cè)定無顯著相關(guān)性(P>0.05)。綜合直觀分析與方差分析的結(jié)果,同時(shí)考慮省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、節(jié)能,最后確定最佳工藝組合為A1B2C3,即10 g膽膏加入適量水溶化,加入 1∶1鹽酸 4 mL沉淀,純化時(shí)間 12 h,然后加入適量去離子水,加入氫氧化鈉0.2 g,溶解過濾即可。
表3 方差分析結(jié)果
分別精密吸取豬去氧膽酸對(duì)照品溶液、鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液、供試品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,測(cè)定峰面積,計(jì)算含量。鵝去氧膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品、供試品、陰性樣品對(duì)照高效液相色譜見圖1。
將圖1A、圖1B和圖1C比較可知,鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間為13.506 min,豬去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間為7.213 min,供試品中鵝去氧膽酸的保留時(shí)間為13.614 min,豬去氧膽酸的保留時(shí)間為7.190 min。由圖1可見,供試品中的鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間、高度和面積基本一致,且HPLC色譜圖峰形良好,無雜質(zhì)干擾測(cè)定,具有較高的特異性,表明分析條件可行。
以對(duì)照品濃度的對(duì)數(shù)x為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)y為縱坐標(biāo)得豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸的回歸方 程 ,分 別為y=1.689 2x+5.570 2,R2=0.999 7;y=1.663 2x+5.502 9,R2=0.999 8。豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸在0.125~0.625 mg/mL線性關(guān)系良好;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為豬去氧膽酸 0.56%、0.68%、0.71%,鵝去氧膽酸0.70%、0.85%、0.66%;豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的加樣回收率分別為99.51%和100.17%,RSD分別為0.75%和0.65%,表明本方法可行。
圖1 高效液相色譜
按乙醇純化和酸堿純化最佳工藝條件A1B2C3純化得到膽膏純化液中總膽酸含量的測(cè)定結(jié)果(表4)。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果2種提取純化工藝所得膽膏純化液中總膽酸含量無顯著差異(P>0.05),表明2種提取工藝的提取效果相似。
表4 不同工藝提取純化總膽酸含量測(cè)定結(jié)果(x±s,n=3)
隨著人類對(duì)天然甾體類化合物的深入研究,從膽膏中提取分離膽汁酸的工藝研究是膽膏研究的熱點(diǎn)之一[12]。目前,國內(nèi)外主要以豬膽汁(膏)為原料提取鵝去氧膽酸或豬去氧膽酸等膽汁酸類[13]。主要通過鈣鹽沉淀法、鋇鹽沉淀法[14]、結(jié)晶提取法和離子交換樹脂法[15]等提取鵝去氧膽酸,然而這幾種方法產(chǎn)品回收率低,純度也不高。對(duì)于豬去氧膽酸的提取,主要采用乙酸乙酯分離法[16],也有采用甲醇-水重結(jié)晶法[17]、乙醇-水重結(jié)晶法、丙酮重結(jié)晶法[18]或?qū)游鲋▽?duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行純化,但這些提取方法不僅需要消耗大量的有機(jī)溶劑,安全性能差,而且生產(chǎn)周期長(zhǎng),產(chǎn)品回收率低,不能規(guī)?;a(chǎn)。
本研究通過酸堿純化工藝提取純化豬膽膏中的膽汁酸,最佳提取工藝為A1B2C3,即在1∶1鹽酸用量4 mL、NaOH用量0.2 g的條件下純化時(shí)間12 h,所得膽膏純化液中總膽酸的含量為5.49 mg/mL;而乙醇純化工藝提取純化的膽膏純化液中總膽酸的含量為5.50 mg/mL。對(duì)比這2種提取純化方法,發(fā)現(xiàn)膽膏純化液中總膽酸的含量無顯著差異,且按《中國人民共和國獸藥典》2015年版注射液有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下檢查純化液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等項(xiàng)目,均符合要求[19]。在制備過程中,受熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致膽膏的某些有效成分損失[20],酸堿純化工藝的作用機(jī)理是利用結(jié)合型總膽酸在酸性環(huán)境下不溶于水的性質(zhì),采用酸化代替乙醇提取,減少加熱次數(shù),提高膽膏中膽汁酸的提取率[21]。何姣等[22]將豬膽汁乙醇浸提和層析柱分離純化后,再使用有機(jī)溶劑洗脫、烘干得到豬膽汁結(jié)合型總膽酸,但提取工藝手續(xù)繁雜,大量使用多種有機(jī)溶劑,結(jié)合型總膽酸的回收率低,成本高。膽膏純化后所得的結(jié)合型總膽酸溶液不必經(jīng)過濃縮和干燥,可直接用于注射液的配制,同時(shí)溶液中含有的牛磺酸具備良好的清熱解毒作用,常用作制備人工牛黃,經(jīng)堿皂化水解后就會(huì)損失此種藥理價(jià)值[23]。相比之下,本研究建立的酸堿純化工藝操作簡(jiǎn)單,純化時(shí)間明顯縮短,并且不使用易燃易爆有機(jī)溶劑。由此可見,酸堿純化工藝在實(shí)用性以及經(jīng)濟(jì)性上均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的乙醇純化工藝,不僅符合綠色生產(chǎn)的工業(yè)化要求,而且還能提高生產(chǎn)效率和生產(chǎn)效益,故推薦選擇酸堿純化工藝作為膽膏中膽汁酸的提取純化方法。