一株桑樹(shù)根際促生菌的篩選鑒定及促生性能研究

楊統(tǒng)一 ，杜秋霞，劉靜霏 ，翟德麗 ，劉延鵬 ，趙衛(wèi)國(guó) ，2

（1.江蘇科技大學(xué)，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

土壤質(zhì)量狀況決定了桑樹(shù)的產(chǎn)量和品質(zhì)，當(dāng)前由于不合理的農(nóng)藝措施如過(guò)量施用化肥，造成土壤酸化及板結(jié)，土壤微生態(tài)失衡，致使桑樹(shù)產(chǎn)出減少、品質(zhì)下降，這促使人們尋找其他肥料來(lái)代替化肥。大量研究發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌（plant growth-promot?ing bacteria，PGPB）能夠通過(guò)代謝活動(dòng)活化土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)、加快生長(zhǎng)等［1，2］。而應(yīng)用富含活性PGPB的微生物肥料有利于修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡，恢復(fù)土壤肥力，引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明，PGPB能夠通過(guò)直接和間接兩種途徑來(lái)促進(jìn)作物生長(zhǎng)［3］，直接作用如分泌植物激素促進(jìn)生長(zhǎng)，分泌有機(jī)酸促進(jìn)難溶磷轉(zhuǎn)化成有效磷，分泌固氮酶等增加土壤肥力，而間接作用包括誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗性、直接與病原菌拮抗等［4，5］。PGPB 作為微生物菌肥的菌種，可持續(xù)性較好，對(duì)環(huán)境和食品安全，還可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，在生態(tài)環(huán)境保護(hù)、綠色有機(jī)食品生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［6，7］。

目前菌肥效果研究發(fā)現(xiàn)在眾多農(nóng)作物上具有良好的應(yīng)用效果，包括小麥、水稻及玉米等［8-10］，而在桑樹(shù)中施用微生物菌肥也能提高桑樹(shù)枝條生長(zhǎng)量及葉片生物量。高繪菊等［11］研究發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)內(nèi)生拮抗細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L144的培養(yǎng)液能明顯提高玉米和桑樹(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)，增加玉米及桑樹(shù)幼苗的株高及植株生物量，提高葉綠素等含量。梁灝琳等［12］在研究3種微生物菌劑對(duì)桑樹(shù)的應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌劑能較好地促進(jìn)桑樹(shù)莖干生長(zhǎng)、葉片增綠及土壤改良。羅海信［13］研究了菌肥對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)桑園施用生物肥料能夠顯著提高桑葉的產(chǎn)量，并能夠提高桑椹的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前影響PGPB菌肥應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一就是優(yōu)良菌種的篩選與培育，但是開(kāi)發(fā)桑樹(shù)生長(zhǎng)促進(jìn)菌優(yōu)良菌株的研究還較少。本研究從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃的桑樹(shù)根際土壤中篩選并鑒定了一株能夠溶磷和分泌IAA的植物根際促生菌，考察了不同pH、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株促生能力的影響，以期為桑樹(shù)?；臀⑸锞实拈_(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

采用抖動(dòng)法采集江蘇科技大學(xué)西校區(qū)蠶業(yè)研究所桑園根際土壤，混勻，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，去離子水定容至 1 000 mL，瓊脂 20 g，pH 7.2～7.4；液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

PKO培養(yǎng)基（無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基）：Ca3（PO4）25 g，C12H22O1110 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.03 g，酵母菌膏0.5 g，去離子水定容至1 000 mL。pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L。

1.3 促生菌篩選與鑒定

1.3.1 溶磷菌株的篩選 采用平板稀釋分離法［8］，稱量5 g土壤樣品用45 mL滅菌的生理鹽水制備成土壤懸液，經(jīng)梯度稀釋后成10-2～10-4濃度土壤稀釋液，取0.1 mL均勻涂布于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d后，挑取有溶磷圈的菌株，進(jìn)行純化和多次傳代后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀察與鑒定。掃描電鏡成像（SEM）：收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌體并用生理鹽水洗滌兩次，用甲醇和乙酸（3∶1）固定2 h。后依次用50%、70%、85%、90%和100%乙醇依次處理20 min，最后將處理好的樣品送學(xué)校分析中心進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）成像。

2）菌株形態(tài)和生理生化特征鑒定。參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和伯杰氏鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌株的形態(tài)和生理生化特性鑒定。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 挑取少許菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.8。取2mL菌液離心后收集菌體。采用煮沸法［14］滴加0.5 mL去離子水于菌體中，渦旋30 s，100℃下水浴5 min，12 000 r/min離心2 min。上清液即為DNA模板，在-20℃下保存。然后用細(xì)菌通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行 16S rDNA擴(kuò)增［15］。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性5 min（95 ℃）；進(jìn)入循環(huán)，變性30 s（94 ℃），退火30 s（55℃），延伸90 s（72℃），運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫度下延伸10 min，4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送至上海Invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16S rDNA序列用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)，然后用MEGA 6.0軟件構(gòu)建出菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.1.2 抑郁癥組 選取我院同期收治的抑郁癥住院患者作為抑郁癥組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)精神疾病分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版（精神障礙分類）》[15]中抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，漢密爾頓抑郁量表（HAMD）評(píng)分≥20分[16]。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期或哺乳期婦女；具有器質(zhì)性精神障礙或者由精神活性物質(zhì)所致的精神障礙者；嚴(yán)重心、肝、腎等實(shí)質(zhì)性臟器損害者；神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病患者；語(yǔ)言聽(tīng)力功能障礙者。該組共納入抑郁癥患者85例。

1.3.4 篩選菌株促生能力的測(cè)定

1）溶磷能力的測(cè)定［4］。用接種環(huán)挑取少許純化的溶磷菌加入50 mL液體LB培養(yǎng)基，在30℃下120r/min搖床培養(yǎng)至菌液吸光值OD600nm為0.8時(shí)，作為種子液，此時(shí)菌體濃度約109個(gè)/mL。將1 mL種子液接種于50 mL PKO液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min下，分別培養(yǎng)6、18、30、48、72 h后，取5 mL樣品，4 ℃下10 000 r/min離心15 min。取上清液定容至25 mL后加入顯色劑，每組3個(gè)平行，通過(guò)鉬銻抗比色法測(cè)定菌株的溶磷能力。

液體PKO培養(yǎng)基的pH對(duì)有效磷的影響測(cè)定：配制pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液體PKO培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h取樣，按照上述方法測(cè)定菌株的溶磷能力。

2）產(chǎn)IAA能力的測(cè)定。對(duì)細(xì)菌分泌IAA的能力定量測(cè)定時(shí)使用分光光度法進(jìn)行［5］。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備。將200 μg/mL的 IAA 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為 0、25、50、75、100、125、150、175 μg/mL，采 用 Salkowski顯 色 法 測(cè) 定 吸 光 值（OD530nm），然后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

挑取少許菌體接種于LB液體培養(yǎng)基，在30℃下120 r/min搖床培養(yǎng)至菌液吸光值OD600nm為0.8時(shí)作為種子液。將0.5 mL種子液接種于含有100 mg/L L-色氨酸的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)下，培養(yǎng)至6、18、30、48、72 h時(shí)，各取1 mL樣品，然后12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液加入等體積Salkowski比色液，混勻后避光靜置30 min后測(cè)定其OD530nm，以不加L-色氨酸的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位體積菌液IAA的含量。

LB液體培養(yǎng)基pH對(duì)IAA分泌量的影響測(cè)定：配制pH為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液體LB培養(yǎng)基，按照上述方法分別計(jì)算菌液分泌IAA的量。

1.4 菌株促生效果的盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)的土壤來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃，土壤的pH為7.5，有機(jī)質(zhì)含量2.9 g/kg，全氮含量0.083%，速效氮含量97.4 mg/kg，總磷含量 659 mg/kg，速效磷含量 3.69 mg/kg［16］。土壤可培養(yǎng)微生物指標(biāo)中，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)［17］。土壤中細(xì)菌數(shù)量為（8.3±0.52）×105/g干土，真菌數(shù)量為（5.7±0.64）×104/g干土，放線菌數(shù)量為（2.4±0.4）×105/g干土（注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）。

挑選飽滿一致的桑樹(shù)種子，用50℃溫開(kāi)水浸泡，水涼后浸泡12 h。催芽后育苗，等長(zhǎng)出兩葉一心時(shí)移栽定植。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康桑樹(shù)苗移栽于塑料盆（含200 g風(fēng)干土壤）中，等桑苗定植一周后，采用灌根法接種促生菌。將篩選出的菌株利用LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心5 min，去除上清液，無(wú)菌水重懸菌體備用。灌根的G2菌液為無(wú)菌水重懸至OD600nm為0.8時(shí)，此時(shí)菌體濃度約109個(gè)/mL。處理組為無(wú)菌水對(duì)照（CK）、稀釋100倍（約含菌體107個(gè)/mL）和200倍（約含菌體0.5×107個(gè)/mL）的種子液，每處理5次重復(fù)，每盆灌根50 mL。

桑樹(shù)苗長(zhǎng)出四葉一心時(shí)，測(cè)量試驗(yàn)組和對(duì)照組桑樹(shù)的株高、鮮重，然后小心剝離土壤后105℃烘干至恒重，稱量地上部干重和根系干重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用Excel及SPSS 16.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生菌株G2的篩選及生理生化鑒定

由圖1a革蘭氏染色結(jié)果可知，篩選出的G2菌株是一種革蘭氏陰性菌；由圖1b可知，G2菌是一種桿菌，大小約為0.5 μm×1.5 μm；由圖1c、圖1d可以證實(shí)，G2菌具有溶磷及分泌IAA的能力。

圖1 G2菌形態(tài)及其他特征

G2菌的生理生化測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，G2菌沒(méi)有發(fā)酵乳糖、葡萄糖及甘露醇的能力；過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，而苯丙氨酸脫氫酶陰性，不能水解淀粉等。

表1 G2菌的生理生化測(cè)試結(jié)果

2.2 菌株G2的16S rDNA分子鑒定

G2菌的16S rDNA擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，將序列提交GenBank獲得登錄號(hào)KT283101。利用Blast進(jìn)行序列同源性分析，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，G2菌株與Pseu?domonas stutzeri具有99%以上的相似性，初步鑒定菌株G2為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）。

2.3 pH和時(shí)間對(duì)菌株溶磷性能的影響

由圖3可知，不同pH顯著影響菌株G2的溶磷性能。隨著pH的升高，G2菌株的溶磷量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在pH為7左右時(shí)，達(dá)到最大值（13.53 mg/L）。

將G2菌株用PKO培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定上清液中有效磷的含量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，剛開(kāi)始菌株可能處于生長(zhǎng)適應(yīng)期，有效磷的含量比較低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株溶解磷的含量增加。48 h左右時(shí)溶解磷含量達(dá)到最大值，為17.96 mg/L。

圖2 菌株G2及相關(guān)菌株基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 pH對(duì)菌株溶磷性能的影響

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株溶磷性能的影響

2.4 pH和時(shí)間對(duì)菌株分泌IAA性能的影響

由圖5可知，在pH為4和10時(shí)，菌株分泌IAA的含量較低。在pH為5、6及7時(shí)，菌株IAA分泌量最多，沒(méi)有顯著差異；隨著pH超過(guò)8，菌體IAA分泌量逐漸減少。綜合表明菌株在pH 5～8時(shí)，分泌IAA的能力都較強(qiáng)，但總的來(lái)說(shuō)，G2菌株較適應(yīng)偏酸性的環(huán)境。

從圖6可知，菌株分泌IAA的能力自6 h快速提高，處于快速增長(zhǎng)階段，并于48 h達(dá)到115.1 mg/L，也就是說(shuō)48 h之前IAA增加速度較快；48 h后IAA含量還在增加，但增加速度較慢，至72 h時(shí)達(dá)到121.7 mg/L。這可能是由于后期營(yíng)養(yǎng)比較匱乏，種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)加劇，導(dǎo)致IAA分泌速度減緩。

圖5 pH對(duì)菌株分泌IAA能力的影響

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株分泌IAA能力的影響

2.5 對(duì)桑樹(shù)苗盆栽的促生效果

由表2可知，該菌株對(duì)桑樹(shù)苗的根系及莖葉都有促進(jìn)作用。其中以稀釋100倍處理促生效果最佳，各項(xiàng)指標(biāo)值均較對(duì)照提高30%以上，與對(duì)照相比，差異達(dá)到顯著水平。

表2 不同處理對(duì)桑樹(shù)苗生物學(xué)特征的影響

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)從土壤中分離得到了一株兼具溶磷和分泌生長(zhǎng)素IAA兩種能力的植物根際促生菌G2，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化特性鑒定、16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為施氏假單胞菌。在pH為7時(shí)，G2菌株的溶磷能力最佳，而pH為5～7時(shí)G2菌株IAA的分泌量最大。培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，G2菌株的溶磷能力達(dá)到17.96 mg/L；而IAA含量72 h時(shí)達(dá)到121.7 mg/L。盆栽試驗(yàn)表明，接種篩選的促生菌G2后，桑樹(shù)苗的株高、鮮重、地上部干重及根系干重分別較對(duì)照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。

當(dāng)前中國(guó)桑產(chǎn)業(yè)逐步從東部沿海地區(qū)向西部地區(qū)轉(zhuǎn)移，隨著果桑新品種的推出，使桑樹(shù)不僅能夠提供桑葉，還能提供營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的桑果，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)村和農(nóng)民的增收起到積極作用，有利于農(nóng)村發(fā)展休閑旅游產(chǎn)業(yè)。由于長(zhǎng)期的不良農(nóng)業(yè)措施，如農(nóng)藥、化肥的大量施用不僅使土壤質(zhì)量下降還破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的平衡，從而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢、發(fā)病率升高等現(xiàn)象［17］。PGPB通過(guò)定植于根部，能夠改變土壤微環(huán)境，活化難以吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善營(yíng)養(yǎng)狀況，還能夠擠占有害病原菌的生態(tài)位，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在桑樹(shù)生長(zhǎng)期間，微生物菌肥不僅能為桑樹(shù)的生長(zhǎng)提供所需的養(yǎng)分，改善桑葉品質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蠶桑副產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，而且還可提高肥料利用率，降低養(yǎng)蠶成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。因此，微生物菌肥可以作為桑園的優(yōu)質(zhì)肥源之一。而獲得優(yōu)良的微生物菌種是開(kāi)發(fā)高效菌肥的前提。

目前，報(bào)道的PGPB有眾多種屬，包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬及土壤桿菌屬等［7，18，19］。假單胞菌屬的促生機(jī)制包括提高養(yǎng)分的可利用性，分泌促生長(zhǎng)的激素，還可以分泌拮抗病原菌的物質(zhì)來(lái)提高植物的抗病性［20，21］。李娜等［22］從石灰性土壤中分離篩選出一株高效溶磷的假單胞菌W05，制成的溶磷菌肥顯著提高了土壤有效磷含量和磷酸酶活性。劉潤(rùn)進(jìn)等［23］將AMF和PGPB（熒光假單胞菌）混勻制備成組合菌劑，顯著降低了土壤中甲胺磷殘留量。本研究從江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所的桑樹(shù)根際土中篩選得到一株具有解磷及分泌生長(zhǎng)素能力的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序比對(duì)，鑒定為施氏假單胞菌。進(jìn)一步研究表明，該菌在pH 5～8時(shí)，具有較好的分泌生長(zhǎng)素的能力，說(shuō)明該菌株能夠適應(yīng)的土壤pH范圍較廣。

目前研究發(fā)現(xiàn)PGPB的促生效應(yīng)在植物的幼苗期具有較好促進(jìn)作用。小麥幼苗在接種假單胞菌HP1218后，在株高及根長(zhǎng)方面比對(duì)照增加13.2%及20.4%［9］。邢丹等［24］以桑品種桑特優(yōu) 2號(hào)為研究對(duì)象，接種兩種叢枝菌根真菌（摩西斗管囊霉及根內(nèi)根孢囊霉）都顯著增加了桑樹(shù)株高、地徑、葉面積、地上部分和根系干質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，接種稀釋100倍的促生菌G2菌液后，桑樹(shù)苗的株高、鮮重、地上部干重及根系干重分別較對(duì)照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。已有研究表明PGPB從兩個(gè)方面起到促生作用：一是能夠產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素如IAA、細(xì)胞激動(dòng)素等；另外一個(gè)方面可以促進(jìn)植物對(duì)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。本研究表明G2菌株能分泌IAA及具有較強(qiáng)的溶磷能力。結(jié)合G2菌株的促生能力研究，其對(duì)桑樹(shù)苗的促生作用可能是IAA增加及促進(jìn)磷吸收這兩個(gè)方面的綜合作用結(jié)果。本試驗(yàn)僅考察了該菌對(duì)盆栽的桑樹(shù)苗促生作用，至于該菌能不能在田間應(yīng)用時(shí)驗(yàn)證促生效果及促生效果能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間還需要進(jìn)一步的研究，為以后制備促生菌劑提供參考。