超高效液相色譜法測定飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量方法的研究

章厲劼， 錢莘莘， 孫真崢， 王慶紅， 廖 歡， 趙 貴

（貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州貴陽 550003）

斑蝥黃又稱角黃素、 斑蝥黃質(zhì)， 化學(xué)名稱為β，β-胡蘿卜素-4，4-二酮（汪洪濤等，2003），存在于某種蘑菇、甲殼類、魚類、藻類、蛋、血液、肝臟等中，含量極微（凌關(guān)庭等，1989），可增加禽皮膚、腳、酮體和蛋的顏色及亮度（王慧文等，2015），應(yīng)用于雞飼料中給“三黃雞”和蛋黃著色（付叔海和劉婷，2017）。 β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯又叫阿樸胡蘿卜素酸乙酯或阿樸酯， 是類胡蘿卜素中一種含氧的阿樸胡蘿卜素類化合物（朱基美，2012），可用于蛋黃和雞肉皮膚著色，對家禽的皮膚、腳脛和皮下脂肪著色有明顯作用（張洪麗，2016）。

但超量使用斑蝥黃， 會造成著色劑在禽蛋中蓄積、殘留，被消費者攝入。研究表明，角黃素的高攝入量可能造成色素在視網(wǎng)膜的累積， 從而影響人的視力（田洋等，2012）。1995 年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）制定了角黃素可接受的每日攝取最大量可達(dá)0.03 mg/kg （按個人體質(zhì)量計）（李紅霞等，2015）。 斑蝥黃和 β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯是我國允許使用的禽飼料添加劑，一般配合使用，并規(guī)定斑蝥黃禽蛋飼料限量為8 mg/kg，肉禽飼料限量為 25 mg/kg；β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯和斑蝥黃同時使用時，總量不超過80 mg/kg（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2017）。

目前，國標(biāo)檢測斑蝥黃主要是液相色譜法—正相法及分光光度法（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2016；中國人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2002），β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯主要是分光光度法 （中國人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2008），鮮有同時檢測飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯的國標(biāo)方法，普適性差，檢測速度慢。 因此，本研究旨在用超高效液相色譜儀建立一種快速、 準(zhǔn)確的同時測定飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯的方法，用于開展飼料中著色劑監(jiān)測， 正確評估禽飼料中著色劑使用情況，確保飼料質(zhì)量安全。

1 實驗材料

1.1 儀器設(shè)備 I-Class 超高效液相色譜儀，Waters 公司生產(chǎn)；3K15 高速冷凍離心機(jī)，SIGMA 公司生產(chǎn)；MS3 旋渦混勻器，IKA 公司生產(chǎn)；Direct-Q8UV-R 超純水機(jī)， 密理博公司生產(chǎn)；N-EVAP-112 氮吹儀， Organomation 公司生產(chǎn)；KQ-250DE超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器公司生產(chǎn)；XS105電子天平 （萬分之一）， 梅特勒公司生產(chǎn)；BT224S電子天平（百分之一），賽多利斯公司生產(chǎn)； ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 （2.1 mm×100 mm，粒度 1.8 μm），Waters 公司生產(chǎn)。

1.2 試劑和溶液

1.2.1 對照品 斑蝥黃: 批號 1013560， 含量97.50%， 德國 Dr.Ehrenstorfer 公司生產(chǎn)；β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯: 批號 CT190218-10， 含量98.57%，美國斯坦福分析化工有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 試劑 甲醇、乙腈，色譜純；正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、冰乙酸、無水乙醇、甲基叔丁基醚、焦性沒食子酸， 分析純； 實驗用水為Direct-Q8UV-R 超純水機(jī)所制超純水。

1.3 實驗樣品 從貴州省9 個市飼料企業(yè)、養(yǎng)殖場抽取的215 份商品飼料或自配飼料， 按GB/T 20195 進(jìn)行制備。

2 實驗方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 斑蝥黃儲備液：稱取斑蝥黃對照品適量，加入0.1 g 焦性沒食子酸，用三氯甲烷超聲溶解配制成濃度為500 μg/mL 的斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯儲備液：稱取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯對照品適量，加入0.1 g焦性沒食子酸， 用三氯甲烷超聲溶解配制成濃度為 500 μg/mL 的 β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

斑蝥黃中間液：準(zhǔn)確量取適量斑蝥黃儲備液，用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液配制成濃度為50 μg/mL 的斑蝥黃中間液。

β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯中間液：準(zhǔn)確量取適量β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯儲備液，用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液配制成濃度為100 μg/mL 的 β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯中間液。

工作液： 準(zhǔn)確量取適量斑蝥黃、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯中間液， 用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液逐級稀釋成系列混標(biāo)工作液。 斑蝥黃濃度為 1.25、2.5、5.0、10 μg/mL；β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯濃度為 2.5、5.0、10、20 μg/mL。

2.2 樣品前處理 稱取濃縮飼料1 g，配合試樣2 g（精確到到0.01 g）于50 mL 離心管中，分別加入水4.0 mL、飽和氯化鈉溶液2.0 mL、0.05%乙酸溶液4.0 mL，搖勻，加入提取劑甲醇-乙酸乙酯-正己烷 （V/V/V=1：1：1）10.0 mL， 渦旋 2 min， 然后5000 r/min 離心5 min，用滴管吸取上層萃取液于另一個離心管，重復(fù)3 次，合并萃取液后，加入2.0 mL無水乙醇（4.6），于40 ℃下氮氣吹干。用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）5.0 mL 溶解殘余物，0.22 μm 微孔濾膜過濾， 上機(jī)測定。 以上操作均在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。

2.3 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm × 100 mm），以乙腈+ 0.1%甲酸水（V/V=1：9）為流動相，等度洗脫色譜條件見表1。

表1 色譜條件

2.4 方法準(zhǔn)確度 稱取空白試樣2.0 g 于50 mL 離心管中， 分別加入斑蝥黃中間液和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯中間液適量， 配制陽性添加樣品，含量見表2。 每個添加量平行制備3份，按2.2 樣品前處理方法制備，上機(jī)測定，以實測含量與理論添加量計算回收率， 考察方法的準(zhǔn)確度，同時計算RSD。

圖2 陽性添加樣含量 mg/kg

2.5 精密度考察 稱取空白試樣2.0 g 于50 mL離心管中， 按表2 中A5 的濃度配制陽性添加樣品6 份，按2.2 樣品前處理方法制備，上機(jī)測定，以實測含量計算RSD，考察精密度。

2.6 方法靈敏度考察 在空白試樣中添加斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，經(jīng)前處理后用超高效液相色譜儀檢測， 依據(jù)色譜峰信噪比S/N＞3 為方法的檢測限，S/N＞10 為方法的定量限。

2.7 實際樣品的檢測 應(yīng)用建立的方法測定215批禽飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 光譜圖 取混標(biāo)工作液上機(jī)測定，斑蝥黃光譜圖見圖1，β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯光譜圖見圖2。

圖1 斑蝥黃光譜圖

圖2 β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯光譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣， 按峰面積進(jìn)行線性回歸計算，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，斑蝥黃回歸方程為 y=37624x+1579，R2=0.99945，見圖3；β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯回歸方程為y=38255x-1527，R2=0.99968，見圖4。斑蝥黃和 β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯線性關(guān)系良好。

圖3 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 方法準(zhǔn)確度考察結(jié)果 方法準(zhǔn)確度考察結(jié)果見表3。斑蝥黃在0.625～10.0 mg/kg 的添加回收率 能 達(dá) 到 72.8% ～ 82.8% ，RSD 為 0.41% ～1.06%；β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯在 2.50 ～40.0 mg/kg 的添加回收率能達(dá)到72.0% ～82.8%，RSD 為0.46% ～1.41%。 從上述分析結(jié)果可以看出，斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯在5 個濃度添加水平上的回收率和RSD 均很好，表明該方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

3.4 精密度考察結(jié)果 精密度考察結(jié)果見表4。

3.5 方法靈敏度考察結(jié)果 測定結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度為0.06 mg/kg 時，斑蝥黃及β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯測定的S/N＞3，方法的檢測限均為0.06 mg/kg；當(dāng)添加濃度為0.20 mg/kg 時，斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯測定的S/N＞10，方法的定量限均為0.20 mg/kg。

3.6 實際樣品的檢測結(jié)果 檢測結(jié)果表明，215批禽飼料中斑蝥黃檢出92 批，β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯檢出59 批，同時檢出的56 批。檢出飼料中，斑蝥黃含量為 0.128 ～ 8.64 mg/kg；β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯含量為0.888 ～16.3 mg/kg。說明該方法能滿足禽飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯含量常規(guī)檢測要求。

表3 斑蝥黃和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯回收率與RSD 結(jié)果（n=3）

表4 斑蝥黃和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯RSD 結(jié)果（n=6）

4 討論

4.1 檢測波長比較 從光譜圖可見斑蝥黃最大吸收為472 nm，β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯最大吸收為445 nm。檢測波長選擇472 nm 時，同濃度斑蝥黃與β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯靈敏度相當(dāng)， 檢測波長選擇445 nm 時， 斑蝥黃靈敏度下降，遠(yuǎn)低于β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯。 飼料中斑蝥黃含量較低，應(yīng)提高斑蝥黃的靈敏度，因此選擇472 nm 為該方法的測定波長。

4.2 提取溶劑的選擇 實驗分別取乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷等有機(jī)試劑進(jìn)行提取，提取效果均不佳。飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯由淀粉包被，有機(jī)試劑無法打開淀粉包被，須先加入水溶液將淀粉包被溶解后， 再加入有機(jī)試劑萃取。 實驗在加入水、飽和氯化鈉溶液、乙酸溶液后選用了乙酸乙酯、三氯甲烷和甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）對樣品進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，測定結(jié)果基本一致，甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）萃取基質(zhì)干擾最少，且毒性相對較低。綜合考慮選擇甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）作為萃取溶劑。

4.3 復(fù)溶液的選擇與優(yōu)化 復(fù)溶液分別選用乙腈-0.1%甲酸水（V/V= 9：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V= 1：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：4）、甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）比較。 乙腈-0.1%甲酸水（V/V= 9：1）測定回收率低。 其余三種復(fù)溶液測定結(jié)果基本一致，但甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：4）復(fù)溶測定時，斑蝥黃及β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯出峰時間會逐漸提前，甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）復(fù)溶測定，出峰時間穩(wěn)定。綜合考慮選用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）作為復(fù)溶液。

4.4 測定儀器的比較 使用超高效液相色譜儀進(jìn)行上機(jī)測定，進(jìn)樣時間在16 min 以內(nèi)； 使用高效液相色譜儀測定至少60 min， 且分離效果不佳。

4.5 β-阿樸-8＇-胡蘿卜素醛同時測定探討 β-阿樸-8＇-胡蘿卜素醛同為農(nóng)業(yè)部2625 號公告中可添加于禽飼料中的添加劑， 化學(xué)性質(zhì)是與斑蝥黃、β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯相似的著色劑，前處理可以同法。 但β-阿樸-8＇-胡蘿卜素醛響應(yīng)太小，且與斑蝥黃分離度差，不適合同時上機(jī)檢測。

5 結(jié)論

本研究建立了一種應(yīng)用超高效液相色譜儀測定飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯的方法，該方法簡便快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，能夠滿足飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8＇-胡蘿卜素酸乙酯含量的常規(guī)檢測要求。