基于色差原理分析不同產(chǎn)地桑白皮有效成分含量與顏色的相關(guān)性

高原 方妍 單夢(mèng)瑤 董金香

摘 要 目的：研究桑白皮藥材有效成分含量與顏色的相關(guān)性，并對(duì)不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行指紋圖譜和聚類分析，為該藥材質(zhì)量控制及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法：分別采用高效液相色譜法（HPLC）和鹽酸-鎂粉反應(yīng)比色法測(cè)定桑白皮中桑根皮素和總黃酮的含量;肉眼觀察桑白皮顏色，采用色差儀測(cè)定其色度值（L*、a*、b*）并計(jì)算總色差值（E*ab）;利用SPSS 21.0軟件對(duì)桑根皮素和總黃酮的含量與各顏色指標(biāo)（L*、a*、b*、E*ab）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。采用HPLC法建立3個(gè)不同產(chǎn)地共20批桑白皮藥材的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度分析。采用SPSS 21.0軟件對(duì)20批樣品進(jìn)行K-均值聚類分析（基于桑根皮素、總黃酮的含量及顏色指標(biāo)）和系統(tǒng)聚類分析（基于指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積）。結(jié)果：桑白皮中桑根皮素和總黃酮的平均含量分別為0.096 0～0.618 6 mg/g、0.48%～1.51%，其各顏色指標(biāo)均呈顯著相關(guān)（P<0.01）。其中，L*、b*、E*ab值越小，a*值越大，則桑根皮素含量越高;L*、b*、E*ab值越大，a*值越小，則總黃酮含量越高。20批藥材樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.883～0.983;標(biāo)定了13個(gè)共有峰，并指認(rèn)1號(hào)峰為綠原酸。K-均值聚類分析結(jié)果顯示，20批樣品可聚為2類，Ⅰ類以安徽產(chǎn)樣品為主，其桑根皮素含量較高、總黃酮含量偏低，顏色較暗、偏黃棕色;Ⅱ類以四川、貴州產(chǎn)樣品為主，其桑根皮素含量偏低、總黃酮含量較高，顏色較明亮、偏黃白色。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果與其較為一致。結(jié)論：桑白皮顏色與其桑根皮素、總黃酮含量密切相關(guān)，顏色偏黃棕色的桑白皮中桑根皮素含量較高，顏色偏黃白色的桑白皮中總黃酮含量較高。

關(guān)鍵詞 桑白皮;顏色;桑根皮素;總黃酮;指紋圖譜;色差原理;聚類分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the correlation between the contents of active ingredients and the color of Morus alba， to establish fingerprint and conduct cluster analysis of samples from different producing areas， so as to provide reference for its quality control and evaluation. METHODS： HPLC and HCl-Mg reaction colorimetry were used to determine the contents of morusin and total flavonoids in M. alba. The color of M. alba was observed by naked eye， and chromaticity values （L*， a*， b*） were measured by color difference meter and color aberration （E*ab）were calculated. Pearson correlation of the contents of morusin and total flavonoids with color indicators （L*， a*， b*， E*ab） were analyzed by SPSS 21.0 software. HPLC method was used to establish the fingerprint of 20 batches of M. alba from 3 different producing areas， and the similarity analysis was carried out. K-means cluster analysis （based on the contents of morusin and total flavonoids and corlor index） and hierarchical cluster analysis （based on relative peak area of common peaks in fingerprint） were performed for 20 batches of samples by SPSS 21.0 software. RESULTS： The average contents of morusin and total flavonoids in M. alba were 0.096 0-0.618 6 mg/g， 0.48%-1.51%， which were significantly correlated with each color index （P<0.01）. The smaller L*， b*， E*ab and the larger a*were， the higher the content of morusin was; the higher the value of L*， b*， E*ab and the smaller the value of a*were， the higher the content of total flavonoids was. The similarity between the fingerprints of 20 batches of samples and the control ranged from 0.883 to 0.983; 13 common peaks were demarcated， and No.1 peak was identified as chlorogenic acid. K-means cluster analysis showed that 20 batches of samples could be divided into 2 categories. Category Ⅰ were mainly from Anhui province with higher content of morusin， lower content of total flavonoids， darker and yellowish brown color; category Ⅱ were mainly from Sichuan province and Guizhou province， with lower content of morusin， higher content of total flavonoids， lighter and yellowish white color. The results of hierarchical cluster analysis were consistent with the results. CONCLUSIONS： The color of M. alba is closely related to the contents of morusin and total flavonoids. The content of morusin in yellow-brown M. albais is higher， while the content of total flavonoids in yellow-white M. albais is higher.

KEYWORDS? ?Morus alba; Color; Morusin; Total flavonoids; Fingerprint;? Color difference of principle; Cluster analysis

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）02-0213-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.15

桑白皮為桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[1-2]，主要分布于我國(guó)河南、安徽、四川、貴州等地?，F(xiàn)代研究表明，桑白皮中含有的桑根皮素（又名“桑辛素”），具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等藥理作用，對(duì)人體免疫缺陷病毒1型M組B亞型（HIV-1SF162）感染具有顯著的抑制活性[3]。此外，總黃酮類成分為桑白皮中的主要藥效成分，具有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)咳平喘、抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、減輕肝損傷等藥理作用[4]。桑白皮因其廣泛的藥理作用，于2002年被列入原衛(wèi)生部發(fā)布的保健食品類中藥名單[5]。

性狀鑒定是中藥鑒定的主要方法之一[6]，桑白皮的傳統(tǒng)鑒別是“以根皮色白、皮厚、味甘者為佳”[7]。顏色作為性狀鑒別的要素之一，與藥材的內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系密切，具有簡(jiǎn)單、直觀的特點(diǎn)，但同時(shí)也存在易受多種外界因素（如視覺(jué)、光學(xué)、生理、心理等因素）的影響而主觀性過(guò)大的缺點(diǎn)[8]，因此建立一種客觀、可量化的顏色分析方法對(duì)快速鑒定藥材質(zhì)量顯得尤為重要。本研究基于色差原理，通過(guò)色差儀對(duì)桑白皮藥材外觀顏色進(jìn)行量化分析（其測(cè)定值L*、a*、b*分別代表明暗度、紅-綠色度、黃-藍(lán)色度[9]），并探討藥材外觀顏色與其主要藥效成分（桑根皮素、總黃酮）含量之間的相關(guān)性;同時(shí)，建立桑白皮藥材指紋圖譜并進(jìn)行聚類分析，旨在為其質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器包括：Agilent 1260型高效液相色譜（HPLC）儀和L5S型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、NH310型電腦色差儀（深圳三恩馳科技有限公司）、EL204型電子天平、MS105型十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、KQ-500B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

桑根皮素對(duì)照品（批號(hào)AF8051823，純度98%）購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;桑根酮C對(duì)照品（批號(hào)18040211，純度≥98%）購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司;綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201817，純度96.8%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;鎂粉（批號(hào)20120312）購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠;磷酸、甲醇、乙腈均為色譜純，鹽酸、乙醇均為分析純，水為純凈水。

20批桑白皮藥材收集自四川、安徽、貴州等3個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為?？浦参锷. alba L.的干燥根皮，其具體信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑根皮素的含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定桑白皮藥材中桑根皮素的含量。

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取桑根皮素對(duì)照品適量，加乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為21.795 2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 精密稱取桑白皮粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）處理30 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件和系統(tǒng)適用性考察 以Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-水（58 ∶ 42，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。取“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下桑根皮素對(duì)照品和供試品溶液（編號(hào)S7）以及空白溶劑（乙醇）進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，桑根皮素的理論板數(shù)大于10 000，分離度大于1.5，且溶劑無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1（空白溶劑圖略）。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下桑根皮素對(duì)照品溶液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mL，加乙醇定容至2 mL，搖勻，即得系列線性溶液。取上述系列線性溶液各適量，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=84.565X+1.181 5（r=0.999 9），表明桑根皮素質(zhì)量濃度在0.681 1～21.795 2 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（編號(hào)S7），按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，桑根皮素峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取桑白皮藥材粉末（編號(hào)S7）適量，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果，桑根皮素含量的RSD為0.87%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桑白皮藥材粉末（編號(hào)S7）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24、48 h時(shí)按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，桑根皮素峰面積的RSD為1.36%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知桑根皮素含量的桑白皮藥材粉末（編號(hào)S7）適量，共6份，均按1 ∶ 1質(zhì)量比精密加入桑根皮素對(duì)照品溶液適量，然后按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為96.80%，RSD為1.43%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表2。

2.1.9 樣品中桑根皮素的含量測(cè)定 取20批桑白皮藥材粉末適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量。每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，20批桑白皮藥材中桑根皮素的平均含量為0.096 0～0.618 6 mg/g，詳見(jiàn)表3。

2.2 總黃酮的含量測(cè)定

由于桑白皮的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中均存在異戊烯基側(cè)鏈，故本研究以桑白皮中含量較高且結(jié)構(gòu)中同樣存在異戊烯基的藥效成分桑根酮C為指標(biāo)，采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)比色法測(cè)定桑白皮藥材中總黃酮的含量[10]。

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取桑根酮C對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.086 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取桑白皮藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）處理60 min，冷卻至室溫，濾過(guò)并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得[10-11]。

2.2.3 顯色方法 精密吸取桑根酮C對(duì)照品溶液或者供試品溶液3 mL，轉(zhuǎn)移至含有300 mg鎂粉的具塞刻度試管中，將試管置于冷水?。s15 ℃）中，緩慢地精密加入濃鹽酸3 mL，時(shí)時(shí)振搖。待反應(yīng)至不再產(chǎn)生氣泡后，補(bǔ)加甲醇至10 mL，搖勻，于沸水浴中加熱1 h，迅速冷卻至室溫，補(bǔ)加甲醇至10 mL，搖勻，備測(cè)。

2.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將桑根酮C對(duì)照品溶液和供試品溶液分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果，桑根酮C對(duì)照品溶液和供試品溶液在484 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，故選擇該波長(zhǎng)作為總黃酮含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，詳見(jiàn)圖2。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密移取桑根酮C對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法反應(yīng)顯色后，在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以桑根酮C質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.015 4X-0.017 6（r=0.999 2），表明桑根酮C質(zhì)量濃度在8.60～43.00 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密移取同一份供試品溶液（編號(hào)S7）3 mL，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為3.58%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批桑白皮粉末（編號(hào)S7）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液;分別精密量取3 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果，總黃酮含量的RSD為4.31%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取桑根酮C對(duì)照品溶液和供試品溶液（編號(hào)S7）各3 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，分別于室溫下放置0、20、40、60、80、100、120 min時(shí)在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，對(duì)照品溶液和供試品溶液吸光度的RSD分別為0.83%、0.60%（n=7），表明兩種溶液在顯色后于室溫下放置120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知總黃酮含量的桑白皮粉末（編號(hào)S7）約0.5 g，共6份，均按1 ∶ 1質(zhì)量比精密加入桑根酮C對(duì)照品溶液適量，然后按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密量取3 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，總黃酮的平均加樣回收率為98.32%，RSD為2.25%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表4。

2.2.10 樣品中總黃酮的含量測(cè)定 取20批桑白皮藥材粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。分別精密量取3 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量。每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，20批桑白皮藥材中總黃酮的平均含量為0.48%～1.51%，詳見(jiàn)表5。

2.3 桑白皮藥材的顏色測(cè)定

采用肉眼觀察并以色差儀測(cè)定桑白皮藥材的顏色。

2.3.1 樣品顏色觀察 取桑白皮藥材適量，置白板上觀察顏色，大致按淺黃白色、黃白色、淺黃棕色、黃棕色、棕褐色等5個(gè)級(jí)別進(jìn)行記錄。

2.3.2 色差儀測(cè)定條件 取桑白皮樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩，下同）適量，均勻平鋪于粉末測(cè)試盒內(nèi)直至裝滿，蓋好蓋玻片。色差儀設(shè)置D65光源，8度視角，孔徑8 mm，LED藍(lán)光激發(fā)，儀器誤差值小于0.4。用黑白板校正儀器后進(jìn)行樣品測(cè)定，記錄色度值（L*、a*、b*，其中L*值越大表示顏色越亮/淺、a*值越大表示顏色越偏紅、b*值越大表示顏色越偏黃[9]），并計(jì)算總色差值（E*ab）：E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取桑白皮樣品粉末（編號(hào)S1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，記錄L*、a*、b*值。結(jié)果，上述色度值的RSD均小于2%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取桑白皮樣品粉末（編號(hào)S1）適量，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定L*、a*、b*值。結(jié)果，上述色度值的RSD均小于2%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桑白皮樣品粉末（編號(hào)S1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平鋪于粉末測(cè)試盒內(nèi)并蓋好蓋玻片后，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)進(jìn)行測(cè)定L*、a*、b*值。結(jié)果，上述色度值的RSD均小于3%（n=8），表明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 樣品的顏色觀察和測(cè)定 取20批桑白皮藥材按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下進(jìn)行顏色觀察和色度值測(cè)定并計(jì)算總色差值。每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.4 桑白皮藥材中有效成分含量與顏色指標(biāo)的相關(guān)性分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)桑白皮中桑根皮素、總黃酮的含量與顏色指標(biāo)（L*、a*、b*、E*ab）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，桑白皮藥材中桑根皮素含量與L*、b*、E*ab值以及總黃酮含量與a*值均呈顯著負(fù)相關(guān)（r<0，P<0.01），桑根皮素含量與a*值以及總黃酮含量與L*、b*、E*ab值則均呈顯著正相關(guān)（r>0，P<0.01）。這表明在一定程度上，桑白皮L*、b*、E*ab值越小，a*值越大，則其桑根皮素含量越高;L*、b*、E*ab值越大，a*值越小，則總黃酮含量越高。由于L*越大表示顏色越明亮，a*>0表示顏色偏紅，b*>0表示顏色偏黃[12-15]，根據(jù)上述Pearson相關(guān)性分析結(jié)果可知：（1）桑根皮素含量與黃藍(lán)值相關(guān)性最大（r絕對(duì)值越大則相關(guān)性越大，下同），在78.1%的程度上其顏色偏黃則桑根皮素含量較低;其次與紅綠值相關(guān)性較大，在75.0%的程度上其顏色偏紅則桑根皮素含量較高;最后與顏色明暗程度較相關(guān)，在70.0%的程度上其顏色越明亮則桑根皮素含量越低。（2）桑白皮中總黃酮含量與顏色明暗程度相關(guān)性最大，在97.0%的程度上顏色越明亮則總黃酮含量越高;其次與紅綠值相關(guān)性較大，在96.3%的程度上其顏色偏紅則總黃酮含量較低;最后與黃藍(lán)值較相關(guān)，在95.5%的程度上其顏色偏黃則總黃酮含量較高。

2.5 桑白皮藥材的指紋圖譜建立

采用HPLC法建立桑白皮藥材的指紋圖譜。

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.014 3 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取桑白皮粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）1 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）處理30 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-甲醇[1 ∶ 1（V/V），A相]-0.1%磷酸水溶液（B相），梯度洗脫（0 min，15%A;18 min，34%A;28 min，50%A;38 min，65%A;60 min，80%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;柱溫為40 ℃;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL[16]。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（編號(hào)S7），按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以1號(hào)峰（綠原酸）為參照計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.14%、0.69%（n=6），表明方法精密度良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取桑白皮藥材粉末（編號(hào)S7）適量，共6份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以1號(hào)峰（綠原酸）為參照計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.52%、1.95%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桑白皮藥材粉末（編號(hào)S7）適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以1號(hào)峰（綠原酸）為參照計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.79%、1.88%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5.7 相似度評(píng)價(jià)及共有峰指認(rèn) 取20批桑白皮藥材樣品粉末適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液按并“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所有樣品色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，生成疊加指紋圖譜（見(jiàn)圖3）;同時(shí)以S1為參照，采用中位數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗為0.1，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜（R，圖略）;對(duì)兩者進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，樣品S1～S20色譜圖與對(duì)照色譜（R）的相似度分別為0.962、0.930、0.941、0.975、0.973、0.972、0.948、0.972、0.883、0.952、0.968、0.978、0.975、0.969、0.983、0.928、0.978、0.952、0.906、0.981;共標(biāo)定13個(gè)共有峰，指認(rèn)1號(hào)峰為綠原酸（綠原酸對(duì)照品溶液按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定所得色譜圖見(jiàn)圖4）。

2.6 不同產(chǎn)地桑白皮藥材的聚類分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)20批不同產(chǎn)地桑白皮藥材樣品中桑根皮素和總黃酮的含量、顏色指標(biāo)進(jìn)行K-均值聚類分析，對(duì)指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)表8、圖5。

由系統(tǒng)聚類分析結(jié)果可知，當(dāng)歐氏距離為10時(shí)，20批樣品可聚為兩類：S7～S11、S13、S17聚為一類，以安徽產(chǎn)桑白皮為主，同時(shí)K-均值聚類分析結(jié)果（該聚類結(jié)果同時(shí)包含S1）表明其桑根皮素含量較高、總黃酮含量偏低，顏色較暗、偏黃棕色;S1～S6、S12、S14～S16、S18～S20聚為一類，以四川、貴州產(chǎn)桑白皮為主，同時(shí)K-均值聚類分析結(jié)果（該聚類結(jié)果不包含S1）表明其桑根皮素含量偏低、總黃酮含量較高，顏色較明亮、偏黃白色。

3 討論

隨著中藥材基原和種類的不斷增多，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)和控制顯得尤為重要，而顏色作為中藥最直觀的外在特征之一，與中藥質(zhì)量密不可分[17]。歷代關(guān)于桑白皮的品質(zhì)評(píng)價(jià)均以“色白，皮厚，味甘者為佳”[7]。然而傳統(tǒng)辨色方法主觀性較強(qiáng)且易受外在因素影響，因此本研究通過(guò)色差儀將主觀性指標(biāo)顏色轉(zhuǎn)化為客觀性指標(biāo)（L*、a*、b*），以期通過(guò)藥材外在表征來(lái)快速評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。

經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地及批次桑白皮中二苯乙烯苷類成分桑皮苷A的含量差異較大，且有文獻(xiàn)表明該成分易受溫度、光照及pH值影響[18]，故本文選擇桑白皮的主要藥效成分總黃酮及化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的桑根皮素進(jìn)行含量測(cè)定，并將其與顏色指標(biāo)L*、a*、b*、E*ab值相關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，桑白皮中桑根皮素和總黃酮含量均與L*、a*、b*、E*ab值呈顯著相關(guān)性。其中，桑根皮素含量與b*值相關(guān)性最大，b*值越小則桑根皮素含量越高，即偏黃棕色的樣品中桑根皮素含量較高;總黃酮含量與L*值相關(guān)性最大，L*值越大則總黃酮含量越高，即偏黃白色的樣品中總黃酮含量較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，安徽亳州產(chǎn)桑白皮產(chǎn)量大、色白、皮厚、柔韌、質(zhì)量好，稱為“亳桑皮”，享譽(yù)全國(guó)[19-20]。本研究中所用產(chǎn)地為安徽的桑白皮整體顏色偏黃棕色，桑根皮素含量較高，總黃酮含量偏低，進(jìn)一步證實(shí)了外觀顏色與其質(zhì)量的相關(guān)性。

中藥材成分的多樣性決定了其質(zhì)量控制的復(fù)雜性，由于產(chǎn)地對(duì)其質(zhì)量和療效影響較大，且其化學(xué)成分與臨床藥理作用之間的關(guān)系尚未明確，通常以多組分聯(lián)合發(fā)揮藥效，可見(jiàn)單一成分不能完全代表藥材質(zhì)量，故指紋圖譜的建立可以從整體上控制藥材質(zhì)量，彌補(bǔ)了單一成分質(zhì)量控制具有片面性的不足[21]。本課題組前期觀察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇等提取溶劑的提取效果，結(jié)果顯示，不同提取溶劑對(duì)成分溶出影響較大，并以70%乙醇提取所得供試品的成分信息較為豐富;同時(shí)，本課題組對(duì)回流和超聲兩種提取方式及不同提取時(shí)間也進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，超聲提取30 min即可提取完全。其次，不同型號(hào)色譜柱對(duì)指紋圖譜的影響也較大，本課題組比較了Agilent TC-C18（2）、Shim-pack C18、Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18等3種色譜柱的分離效果，結(jié)果以Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18的效果最佳。此外，本課題組在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)320 nm波長(zhǎng)下得到的圖譜信息較豐富且各色譜峰分離較好，故選擇320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，并以該條件下出峰穩(wěn)定的第1號(hào)峰（綠原酸）作為參照峰。

最后，本文對(duì)不同產(chǎn)地桑白皮藥材進(jìn)行了聚類分析，基于桑根皮素和總黃酮含量以及顏色指標(biāo)的K-均值聚類分析結(jié)果顯示，桑白皮可分為兩類，即樣品S1、S7～S11、S13、S17聚為一類，其余批次聚為另一類;基于桑白皮指紋圖譜相對(duì)峰面積進(jìn)行的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，樣品S7～S11、S13、S17聚為一類，其余批次聚為另一類。由此可知，以不同指標(biāo)進(jìn)行聚類分析所得的結(jié)果較為一致，即安徽產(chǎn)樣品聚為一類，四川、貴州產(chǎn)樣品聚為另一類。四川、貴州產(chǎn)樣品質(zhì)量相近的原因可能為這兩個(gè)地區(qū)的地理位置較接近，土壤、氣候、生態(tài)環(huán)境等較為相似;而安徽地處中緯度地帶，季風(fēng)氣候明顯，降水充沛，與四川、貴州存在一定產(chǎn)地差異。

綜上所述，桑白皮有效成分（桑根皮素、總黃酮）的含量與其顏色具有相關(guān)性，且不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量存在一定差異。本研究為桑白皮藥材的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，但關(guān)于該藥材中其他成分與顏色的相關(guān)性以及其他產(chǎn)地樣品間的差異有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-06-23 修回日期：2020-11-28）

（編輯：段思怡）