頭針聯(lián)合中藥對缺血性腦卒中失眠大鼠模型p38MAPK濃度的作用*

張 野，叢德毓，汲廣成，王宇峰，婁惠娟，張紅石△

(1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫(yī)院，吉林 長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長春 130117)

缺血性腦卒中后失眠是臨床常見疾病，缺血性腦卒中患者中有較多患者在不同程度上會出現(xiàn)失眠[1]。據(jù)流行病學統(tǒng)計卒中后患者失眠發(fā)病率為48.67%～68%，相對于正常人群中的失眠發(fā)生率是顯著升高的[2]，失眠是影響卒中治療和恢復的主要障礙，而且可能會增加卒中的復發(fā)率和死亡率，同時也會相繼出現(xiàn)抑郁傾向，所以失眠與腦血管病變密切相關(guān)。

大鼠P38絲裂源活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化后可被激活，參與炎癥、應激反應和細胞凋亡等，是機體眾多細胞轉(zhuǎn)導通路的中轉(zhuǎn)站，是各類炎癥反應以及神經(jīng)突觸傳遞信號作用的重要激酶[3]。與坐骨神經(jīng)損傷、褥瘡組織壞死、癡呆、失眠和促進腫瘤細胞凋亡等發(fā)生機制有關(guān)[4]，對腦損傷后各類疾病的影響值得進一步研究。有研究表明p38MAPK在阿爾茨海默癥血液與疾病持續(xù)時間呈正相關(guān),且在大腦與學習、記憶和睡眠相關(guān)區(qū)域中高度表達[5]。在各種失眠動物模型中也僅證實了p38MAPK參與Aβ誘導的神經(jīng)元損傷的證據(jù)，p38MAPK活性在失眠的病理發(fā)展中起著重要作用，抑制認知神經(jīng)元細胞中p38MAPK的激活是失眠的治療途徑之一[6]。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)屬于星形膠質(zhì)細胞變化的標記物，受應激反應變化，腦損傷后一般表達增加，具有促進軸突再生和神經(jīng)重構(gòu)的功能，同時也介導神經(jīng)活性物質(zhì)相關(guān)的多種炎性細胞因子變化，如TNF-α、GFAP可能是誘導p38MAPK變化的通路之一[7]。β-內(nèi)啡肽(β-EP)是人體一種具有止痛、鎮(zhèn)靜作用的物質(zhì)，有研究認為睡眠剝奪會導致β-EP表達水平下降，β-EP與GFAP常被用于神經(jīng)應激反應一類的研究[8]。

1 實驗材料

1.1 動物及分組

從長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司購買SD大鼠30只，體質(zhì)量220～230 g，進入長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，隨機分3組，每組10只，其中兩組進行腦卒中后失眠造模，隨機選擇1組作為頭針聯(lián)合中藥組進行頭針和中藥治療，另一組作為模型組不治療，未造模一組作為空白組，飼養(yǎng)間保持溫度為23 ℃、12/12 h光照周期，溫度(55±10)%，并自由飲水。實驗已通過長春中醫(yī)藥大學倫理委員會審批(20190151)。

1.2 主要儀器及試劑

Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展責任有限公司)；視頻分析系統(tǒng)Smart version3.0.04；華佗牌一次性針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)；大鼠P38MAPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；大鼠β-EP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(組織勻漿)(南京建成)；大鼠GFAP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；大鼠P38MAPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒96T(血清、血漿)(南京建成)；組織勻漿器(美國KONTES)；低溫高速離心機(德國Eprendorf);Biotek Synergy HTX多功能微孔板檢測儀(biotek寶特伯騰)；10%水合氯醛(北京試劑公司)。

2 實驗方法

2.1 缺血性腦卒中模型的建立

采用大腦中動脈栓塞灌注造模法，術(shù)前24 h大鼠停止喂養(yǎng)但是可以飲水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，確保全程無痛。大鼠仰臥固定后消毒。在頸部正中縱切一小口，鈍性分離組織和腺體，撥開肌肉可見左側(cè)頸總動脈，分離左側(cè)頸內(nèi)動脈和頸外動脈，掛線備用，結(jié)扎頸外動脈。再結(jié)扎頸總動脈，夾閉頸內(nèi)動脈。在頸總動脈上距離分叉2 mm處剪一斜口，插入線栓，輕提頸內(nèi)動脈縫合線并松開頸內(nèi)動脈血管夾，沿頸內(nèi)動脈將線栓穿過顱骨直至手下有明顯阻力時(約18 mm)，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞，導致腦缺血。以縫合線結(jié)扎切口并固定住線栓，剪斷多余部分縫合線，縫合傷口后，給予大鼠注射青霉素20萬單位防止感染，完成造模。造模后隨即進行神經(jīng)功能評分。

2.2 卒中后失眠模型的建立

采用失眠動物模型PCPA法造模，卒中模型成功后1 d，腹腔注射400 mg/kg的PCPA懸濁液2 mL，1次/d，連續(xù)注射2 d。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂，對外界敏感，第3天中午腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg，翻正反射試驗消失為成功。

2.3 干預方法

中藥選用益腦復健方，出自《成方制劑》，為國醫(yī)大師任繼穴創(chuàng)立[9]，臨床應用廣泛，方由赤芍、川芎、蒲黃、葛根、槐花、地龍、紅花、豨薟草和三七組成，該方可以活血散瘀、行氣醒神，藥效和緩而少有副作用，適用于中風后緩解期局部腦組織缺血后諸證。頭針是取用腦的頂區(qū)及頂前區(qū)，參考于致順教授頭針叢刺理論，結(jié)合《大鼠穴位圖譜》[10]在頂骨正中的百會穴及旁開5 mm處進行定位取穴。

聯(lián)合組在造模成功后，首先以益腦復健方中藥灌胃，按照成人1/30的比例用量，以赤芍、川芎、蒲黃、葛根、槐花、地龍各20 g,紅花12 g,豨薟草30 g,三七18 g，加適量水熬2 h，剩余藥液300 mL。給藥時每只大鼠灌胃5 mL。頭針治療在灌胃后進行，先取百會穴，以針灸針(0.25 mm×13 mm)向前斜刺10 mm，再在百會穴兩側(cè)旁開約5 mm處，沿皮朝鼻尖向前斜刺10 mm，進針后以捻轉(zhuǎn)方式快速行針30 s，以小塊醫(yī)用膠布(5 mm×10 mm)固定，采取叢刺法和長留針的方式，放入無墊料籠中，配合帶針運動，留針6～8 h，1次/d，每周針刺5次，持續(xù)2周。

2.4 大鼠行為學檢測

Morris水迷宮試驗：用于測試大鼠的復雜記憶能力和空間定位能力。水迷宮(ZS-001moriss)由1個圓柱形水槽和圖像采集分析系統(tǒng)構(gòu)成(DIGITAL CCD CAMERA)，四周圍有遮光簾，從而減少外界干擾，利用動物求生本能，尋找隱藏水中的平臺，記錄每只大鼠所需要的時間和路線。

2.5 血清和腦組織中p38MAPK濃度測定

在治療周期結(jié)束后，分別將空白組、模型組和聯(lián)合組的大鼠以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，確保大鼠肌肉放松并且無痛，剪開腹腔，腹主動脈取血5 mL，并將血樣本離心(2 000×g，4℃、15 min)，離心后獲得上層血清。大鼠處于麻醉狀態(tài)，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本充分勻漿并離心(2000×g，4 ℃、15 min)，收集上清液體備用。采用ELISA法檢測大鼠血清及腦組織p38MAPK、β-EP和GFAP含量，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行實驗。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS24.0軟件對所有結(jié)果進行統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后對比采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 建模結(jié)果

建模后大鼠具有正常生命體征，皆未出現(xiàn)腹膜炎跡象，觀察各組大鼠造模前后的行為學變化，水迷宮測試結(jié)果顯示造模前3組差異無統(tǒng)計學意義，造模后兩組與空白組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示造模成功。見表1。

表1 各組大鼠造模前后水迷宮測試時間比較

3.2 各組大鼠p38MAPK濃度比較

大鼠血清中p38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。大鼠腦組織中p38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清與腦組織內(nèi)p38MAPK比較

3.3 各組大鼠血清中β-EP、GFAP濃度比較

大鼠血清中β-EP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。大鼠血清中GFAP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中β-EP、GFAP濃度比較

3.4 治療2周后大鼠行為學功能比較

觀察3組大鼠在治療前后的行為學變化。水迷宮測試結(jié)果顯示聯(lián)合組在治療前后比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，治療后模型組分別和空白組、聯(lián)合組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如表4。治療后模型組、空白組和聯(lián)合組大鼠行為學路線比較，如圖1。

表4 各組大鼠治療前后水迷宮測試時間比較

圖1 各組大鼠治療后水迷宮測試路線比較

4 討論

缺血性腦卒中后的失眠是腦卒中的重要并發(fā)癥，是腦動脈梗死而引起的腦組織缺血和缺氧而導致，尤其以老年患者或有失眠病史者發(fā)病率高，《黃帝內(nèi)經(jīng)》寒熱病篇記載:“足太陽有通頂入于腦者……入腦乃別陰跡、陽跡，陰陽相交，陽入陰出，陰陽交于目銳眥，陽氣盛則瞋目，陰氣盛則瞑目”，論述了頭和睡眠障之間的密切聯(lián)系。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》營衛(wèi)生氣篇中也論述:“肌肉枯，氣道澀，五臟之氣相摶，其營氣衰少而衛(wèi)氣內(nèi)伐，故晝不精，夜不瞑”，強調(diào)了肢體經(jīng)脈不通或津液不足會對睡眠造成影響，臨床上卒中后痙攣患者往往出現(xiàn)失眠或者焦慮癥狀，而針刺和中藥屬于傳統(tǒng)的常用方法，臨床聯(lián)用療效顯著，有實驗表明針灸和中藥可以抗血栓、保護血管，能夠?qū)ρ軆?nèi)皮組織細胞產(chǎn)生影響[11]，從而促進血管內(nèi)皮再生和重塑，增加側(cè)支循環(huán)。長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派依據(jù)學術(shù)經(jīng)驗和現(xiàn)代研究理論，采用頭針聯(lián)合中藥的治療方案進行治療，一方面用中藥改善腦部血液循環(huán)，行氣化瘀，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞，促進血管再生，增加腦內(nèi)氧供給量，另一方面以頭針疏通頭部經(jīng)脈，著重鎮(zhèn)靜安神，調(diào)節(jié)腦內(nèi)氣血逆亂，從而達到治神與調(diào)形兼顧的效果，應用較廣，臨床觀察研究效果確切，在作用機理方面仍然缺乏足夠認識。

頭針聯(lián)合中藥治療方案是基于長白山活血通經(jīng)的傳統(tǒng)治療原則和腦缺血后的血管再生保護機制而確立，血管再生是通過血管內(nèi)皮細胞的分化增殖轉(zhuǎn)運、重組分裂而形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，從而改善局部血液循環(huán)和血氧供應，與中醫(yī)的活血通經(jīng)理論具有一致性[12]，在以往的臨床治療中具有良好療效，但是缺少理論機制的研究。腦卒中是由于大腦動脈突然閉塞而導致的腦血流減少，腦組織由于循環(huán)不足、缺少氧氣以及能量不足而導致神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等功能損害，致使失眠等一系列病變[13]。基于《靈樞》“頭有氣街”論述，中醫(yī)學認為“頭氣有街”，頭氣源于自身經(jīng)絡(luò)之氣血，是頭部重要的血氣之道，張景岳也認為:“頭面為人之首，凡周身陰陽經(jīng)絡(luò)無所不聚，故氣血皆上行頭面而走諸竅”。所以結(jié)合缺血性腦卒中與頭氣街的聯(lián)系，應用頭針的方法對卒中后失眠進行治療。治療腦卒中失眠主要選取頂區(qū)和頂前區(qū)以及額區(qū)，并以頭部的重要經(jīng)脈督脈作為縱向維度基準，既符合頭針分區(qū)理論又兼顧通督調(diào)神的理念。中藥選取赤芍、紅花、川芎和三七化瘀通絡(luò)、緩急消腫；蒲黃、槐花和豨薟草平肝祛風、清厥陰熱，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)赤芍、川芎、葛根和地龍皆不同程度上具有解痙鎮(zhèn)靜的作用。故依據(jù)臨床實踐對于卒中后失眠的治療，并進行對腦卒中后失眠大鼠模型治療的實驗，結(jié)合p38MAPK等相關(guān)物質(zhì)探索其作用機制。

p38MAPK是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中重要的物質(zhì)，能夠參與多條生物刺激信號通路發(fā)生，在腦組織損傷中參與細胞凋亡的物質(zhì)[14]，在與海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)的中樞系統(tǒng)中p38MAPK與學習、記憶和睡眠功能相關(guān)[15]，在海馬區(qū)域高度表達，尤其血管癡呆后大鼠腦內(nèi)p38MAPK升高[16]，可能是與學習、記憶和睡眠相關(guān)細胞生長、凋亡炎癥或反應應激過程的關(guān)鍵信號[17]。實驗結(jié)果表明，模型組的血清內(nèi)檢測p38MAPK濃度高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。造模后模型組的腦組織內(nèi)p38MAPK濃度高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，大鼠血清中β-EP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；聯(lián)合組治療后與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；大鼠血清中GFAP濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明腦卒中后失眠大鼠模型的血液及腦組織中p38MAPK濃度皆受到影響，且與之有關(guān)的β-EP、GFAP兩種物質(zhì)在血清中也相應變化，從而改善睡眠。Wen LiFang關(guān)于p38MAPK參與Aβ誘導神經(jīng)元損傷的研究認為腦組織中Aβ大量聚集，會誘導細胞毒性，從而導致一系列信號通路紊亂。楊申[18]認為p38MAPK在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，其被磷酸化激活后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導p38-caspase-3促進凋亡通路，可以改善其學習記憶能力下降。有研究也證明p38MAPK是導致失眠發(fā)生的物質(zhì)之一,且相關(guān)通路具有促進神經(jīng)元生長作用[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20]p38MAPK可影響VD大鼠學習記憶能力。治療后聯(lián)合組血清內(nèi)p38MAPK濃度低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，聯(lián)合組腦組織內(nèi)p38MAPK濃度低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預p38MAPK從而恢復卒中后大鼠失眠。

5 結(jié)論

綜上,大鼠腦組織和血清內(nèi)p38MAPK濃度升高與大鼠缺血性腦卒中的失眠發(fā)生相關(guān)，大鼠血清和腦組織內(nèi)p38MAPK相關(guān)通路參與卒中大鼠睡眠恢復過程，頭針聯(lián)合中藥的治療方案可以促進卒中后失眠大鼠模型血清及腦組織內(nèi)p38MAPK的濃度降低，可能是促進修復受損傷大鼠模型的空間記憶能力和睡眠功能的重要因素。