電針刺激足陽明胃經(jīng)對(duì)脊髓損傷大鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α、MIP-2表達(dá)的影響*

惠寧軍,閆紅霞,葉義平,馬家富,周祥興

(梧州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 梧州 543000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是臨床常見的創(chuàng)傷性疾病，常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下發(fā)生截癱，同時(shí)帶來諸如肺炎、尿路感染、慢性腎炎和腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)患者身心造成巨大傷害[1-3]。據(jù)美國國家SCI統(tǒng)計(jì)中心統(tǒng)計(jì)，SCI美國發(fā)病率為53/100萬，并且每年預(yù)計(jì)增加1.7萬余人，不完全性截癱患者發(fā)生率為45%，且僅有0.4%的患者可以恢復(fù)正常[4]。SCI發(fā)生以后許多炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10、IL-6及IL-4等呈高表達(dá)的趨勢(shì)，SCI發(fā)生以后損傷局部促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促使損傷局部內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂[5]，在SCI的神經(jīng)再生當(dāng)中發(fā)生正面或者負(fù)面的影響。TNF-α通過趨化因子MIP-2的趨化作用激活中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生大量蛋白水解酶及氧自由基等破壞作用物質(zhì)，加重脊髓損傷的發(fā)生，在脊髓損傷炎癥的發(fā)生與表達(dá)中起重要作用[6-7]。本課題通過制作SCI大鼠模型，以PCR、WB技術(shù)檢測(cè)TNF-α、MIP-2基因及蛋白的表達(dá)，總結(jié)電針刺激對(duì)SCI大鼠的生物醫(yī)學(xué)作用，初步探討電針干預(yù)對(duì)SCI神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)201712001)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)提供SPF級(jí)SD雌性大鼠共70只，體質(zhì)量180 g左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 解剖剪-直(商品型號(hào)：S13005-14)、精細(xì)剪-尖頭(商品型號(hào)：S12012-12)、止血鉗-彎(商品型號(hào)：F23006-14)、不銹鋼微型血管夾(商品型號(hào)：R31005-10)、血管夾夾持器-配合不銹鋼微型血管夾(商品型號(hào)：R34001-14)、持針鉗-直(商品型號(hào)：F31031-15)、醫(yī)用縫針(商品型號(hào)：F33111-24)、縫線(商品型號(hào)：F34004-00)均選購于深圳瑞沃德生命科技有限公司；華佗牌電子針療儀(商品編號(hào)：30440175116)、華佗牌無菌針灸針(商品編號(hào)：30440175332)均由昆明康盛醫(yī)療器械有限公司提供。Brdu(antibody公司，貨號(hào)：66241-1-Ig)，注射用青霉素鈉(南京諾維贊，貨號(hào)：Q111-01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組

70只大鼠中64只隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、預(yù)標(biāo)記組、損傷后標(biāo)記組和足陽明胃經(jīng)電針干預(yù)組(以下簡稱電針組)，每組16只，剩余6只作為死亡大鼠備用。因?yàn)楸菊n題組有檢測(cè)增殖細(xì)胞的必要，故需應(yīng)用Brdu腹腔注射作為增殖細(xì)胞的標(biāo)記。①以標(biāo)記損傷前保持分化增殖的細(xì)胞為目的，予對(duì)照組及預(yù)標(biāo)記在操作前給予Brdu連續(xù)10 d腹腔注射，預(yù)標(biāo)記組于第11天制作脊髓損傷模型，分別于第3天、10天、17天、24天取材，對(duì)照組于第11天行胸10節(jié)段椎板切除；②標(biāo)記損傷后活化增殖的細(xì)胞為目的，給予電針組、損傷后標(biāo)記組在制作脊髓損傷模型后連續(xù)10 d腹腔注射Brdu，電針組予足陽明胃經(jīng)足三里、伏兔穴電針干預(yù)，干預(yù)完畢后分別于損傷后3 d、10 d、17 d與24 d取材。

1.3 實(shí)驗(yàn)大鼠造模

充分麻醉后行俯臥位，去毛消毒備皮，平剪剪開T9～11皮膚，切開約5 cm，逐步切開皮下筋膜、豎脊肌和脊間肌以充分暴露手術(shù)節(jié)段棘突、橫突、椎板和錐弓根等結(jié)構(gòu)，輕度彎曲脊柱，以T9～10椎間隙為突破口小心的咬掉T10椎板，慢慢咬至錐弓根直至椎體邊緣，術(shù)野中清晰的暴露硬脊膜包裹的脊髓，以微型血管夾夾閉脊髓，夾閉25 s以后松開，夾閉過程中如見大鼠尾巴左右擺動(dòng)或者松開血管夾后見以肉眼可見淤血痕跡是為造模成功，具體實(shí)驗(yàn)步驟見圖1所示。術(shù)后逐層縫合筋膜、肌肉和皮膚，為防感染術(shù)后3 d進(jìn)行腹腔青霉素注射。

注：A實(shí)驗(yàn)大鼠及器械；B暴露脊髓組織；C微型血管夾夾閉脊髓組織；D可見夾閉后的脊髓夾痕。

1.4 造模后大鼠的電針干預(yù)

足陽明胃經(jīng)電針干預(yù)組給予足三里及伏兔穴電針干預(yù)，穴位選取參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]，針刺深度2 mm，電針選擇疏密波，刺激強(qiáng)度12～15 mV，留針時(shí)間30 min，每個(gè)周期連續(xù)干預(yù)5 d，周末2 d休息。對(duì)照組和預(yù)標(biāo)記組、損傷后標(biāo)記組不進(jìn)行電針干預(yù)。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 BBB評(píng)分 國際公認(rèn)能精準(zhǔn)的用于損傷后下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)[9]。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR) 將凍存脊髓組織用液氮浸潤研磨后，取100 μL樣本勻漿加入1 mL TRIzol提取總RNA，對(duì)RNA濃度進(jìn)行測(cè)定，電泳檢測(cè)RNA純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)大鼠內(nèi)參GAPDH、TNF-α和MIP-2引物,詳見表1，按試劑盒操作說明配置體系后用ABI7500熒光定量PCR儀擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行處理，計(jì)算目的基因的相對(duì)內(nèi)參的表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.3 Western blot(WB檢測(cè)) 將脊髓標(biāo)本置于液氮并研磨提取組織蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，各標(biāo)本蛋白樣品加上樣緩沖液；制備SDS-PAGE凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗共孵育(TNFα蛋白抗體稀釋比1∶400；MIP-2蛋白抗體稀釋比1∶200)、洗滌、二抗共孵育、顯影、凝膠成像儀成像、拍照記錄和灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-α、MIP-2基因mRNA表達(dá)量比較

TNF-α、MIP-2 mRNA在預(yù)標(biāo)記組、損傷后標(biāo)記組、電針組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第3天和第10天時(shí)，損傷后標(biāo)記組mRNA表達(dá)高于預(yù)標(biāo)記組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；17 d和24 d時(shí)，損傷后標(biāo)記組mRNA表達(dá)略低于預(yù)標(biāo)記組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與預(yù)標(biāo)記組和損傷后標(biāo)記組比較，電針組mRNA表達(dá)明顯降低，到24 d基本接近正常水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明在電針治療下，隨著損傷不同程度的修復(fù)，炎癥因子mRNA表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)正常。詳見圖2～3、表2～3。

圖2 TNF-α擴(kuò)增曲線圖

圖3 MIP-2擴(kuò)增曲線圖

表2 不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α mRNA表達(dá)量

表3 不同時(shí)間點(diǎn)MIP-2 mRNA表達(dá)量

2.2 各組TNF-α、MIP-2蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組相比，TNF-α、MIP-2在預(yù)標(biāo)記組、損傷后標(biāo)記組和電針組均有一定程度的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；損傷后標(biāo)記組與預(yù)標(biāo)記組比較，3 d和10 d時(shí)略高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；17 d和24 d時(shí)略低于預(yù)標(biāo)記組，但是整體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與預(yù)標(biāo)記組和損傷后標(biāo)記組相比，電針組整體明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。到24 d基本接近正常水平。說明在電針治療下，隨著損傷不同程度的修復(fù)，炎癥因子蛋白表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)正常。詳見表4～5、圖4。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α蛋白表達(dá)量

表5 不同時(shí)間點(diǎn)MIP-2蛋白表達(dá)量

注：A為對(duì)照組；B為預(yù)標(biāo)記組；C為損傷后標(biāo)記組；D為電針組。

3 討論

SCI分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性脊髓損傷發(fā)生后，機(jī)體隨之出現(xiàn)包括缺血、缺氧、出血、水腫和炎癥等病理變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂[10-12]，局部組織缺血、缺氧導(dǎo)致血管活性物質(zhì)的釋放及脊髓血液灌流的改變被視為脊髓缺血而致再灌注損傷[13]。SCI發(fā)生后炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子是繼發(fā)性SCI隨之發(fā)生的重要原因之一[14]。MIP-2通過與其受體CCR2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子TNF-α刺激激活微型血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附因子的表達(dá)，從而激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生，最終導(dǎo)致白細(xì)胞聚集、粘附加重?fù)p傷區(qū)域炎癥反應(yīng)，從而激活膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致膠質(zhì)增生和膠質(zhì)瘢痕形成及繼發(fā)的毒性作用，最終導(dǎo)致脊髓組織炎性壞死[15-17]。潘宏等[18]在研究中指出電針刺激可能是通過參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的乙酰膽堿釋放的調(diào)控，激活細(xì)胞表面的a7亞單位的N型ACh受體(a7nAChR)，從而減少炎性TNF-α的釋放[19]。

脊髓損傷中醫(yī)古稱“體惰”，屬于“痿病”之范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》提出:“治痿獨(dú)取陽明”，并成為后世治痿準(zhǔn)則，《素問·痿論》解釋了其機(jī)理：足陽明胃經(jīng)為五臟六腑之海，臟腑充盈，氣血運(yùn)行通暢，則筋骨強(qiáng)、關(guān)節(jié)通利。所以《靈樞·根·結(jié)》有云：治療痿病，取之陽明。“足三里”穴為足陽明胃經(jīng)之合穴，是人體強(qiáng)壯大穴，針刺足三里可補(bǔ)益素體陽氣，增補(bǔ)氣血之虧損，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)益氣血和舒筋通絡(luò)之功，古人把“足三里”穴視為疾病治療要穴，《千金翼方·雜法第九》有言：凡一切疾病，皆可灸足三里；“伏兔”穴位于膝上6寸大腿外側(cè)，起于肉間，往下穿過皮膚筋膜后為股直肌，是為維持下肢功能主要肌肉，基于以上理論故針刺足陽明胃經(jīng)取“足三里”“伏兔”穴。針刺治療強(qiáng)調(diào)平衡氣血、調(diào)和陰陽，遵循的是補(bǔ)虛瀉實(shí)原則，故為治痿的主要方法，電針是在傳統(tǒng)中醫(yī)針刺的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代物理療法，通過電流波對(duì)針刺穴位進(jìn)行刺激，電刺激通過膠原纖維實(shí)現(xiàn)信息及能量的傳輸，既保留了針刺作用又通過電信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)患者的末梢直接發(fā)揮作用而促進(jìn)神經(jīng)興奮，具有針刺刺激及電流刺激的雙重作用[20-22]。本研究為驗(yàn)證電針刺激足陽明胃經(jīng)是否能對(duì)脊髓損傷局部組織驗(yàn)證產(chǎn)生影響作用，通過采用造模穩(wěn)定的鉗夾法制作脊髓損傷大鼠模型并予電針干預(yù)足陽明胃經(jīng)穴位“足三里”“伏兔”穴。研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)電針組MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第3、10、17天電針組對(duì)比未經(jīng)電針干預(yù)的對(duì)照組、預(yù)標(biāo)記組和損傷后標(biāo)記組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在電針干預(yù)進(jìn)行到第24天時(shí)損傷區(qū)域MIP-2、TNF-α基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平趨近對(duì)照組正常水平，結(jié)果顯示電針干預(yù)可以逐漸的減少M(fèi)IP-2、TNF-α的表達(dá)水平，證明電針刺激可以通過減少損傷脊髓組織炎癥反應(yīng)，從而減少脊髓組織的壞死。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究通過SCI大鼠的TNF-α、MIP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)證明電針可通過刺激足陽明胃經(jīng)之“足三里”“伏兔”穴減少TNF-α、MIP-2的釋放，促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。