大黃的炮制對(duì)生大黃、熟大黃5種游離蒽醌含量的影響測(cè)定*

張 如，魏江存，馬家寶，楊正騰△，王成龍

1廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，廣西 南寧530003；2廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

大黃屬中藥瀉下藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.，唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］。掌葉大黃和唐古特大黃被稱為“北大黃”，主產(chǎn)于青海、甘肅等地；藥用大黃稱為“南大黃”，主產(chǎn)于四川、陜西等地［2］。我國有45個(gè)品種和2個(gè)亞種的大黃，但2015版《中華人民共和國藥典》只收錄3種大黃，即正品大黃、唐古特大黃和藥用大黃的干燥根及根莖，主要有效成分有蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、沒食子酸、番瀉苷類、鞣質(zhì)、大黃多糖和微量元素等成分［3-4］。大黃性苦、寒，歸脾、胃、大腸、心、肝經(jīng)，其藥理作用非常廣泛，如：瀉下、消炎、抗菌、抗病毒、利膽、止血、降血脂、降血壓等［5-6］。

炮制是提高中藥臨床療效的重要手段，炮制后藥物藥性改變，成分變化［7-13］，根據(jù)辨證施治的需要，合理選用不同的炮制品，才能提高中藥的療效，減少毒副作用［14-16］。臨床應(yīng)用大黃時(shí)除了使用生品外，也常使用炮制品，其中以生大黃、熟大黃、酒大黃、大黃炭最為常用，2015版《中華人民共和國藥典》收載有生大黃、酒大黃、熟大黃、大黃炭4種炮制品。

中藥大黃含有多種有效成分，在加熱蒸炒炮制過程中，其所含有效成分含量變化很大，藥效也隨之發(fā)生改變［9，12］。筆者采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時(shí)測(cè)定生、熟大黃中5種游離蒽醌成分，為綜合評(píng)價(jià)大黃不同炮制品質(zhì)量提供了方法。

1 材料

1.1 試藥與試劑蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（純度＞98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：160520、170219、170224、160124、160602）；甲醇（美國Fisher科學(xué)世界公司，色譜純）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；分析純）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器Waters 2695型高效液相色譜儀（包括2489UV，四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站）；純水儀（法國，密理博）；PRACTUM224-KN SOP型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；45 μm微孔濾膜。

1.3 大黃的炮制工藝

1.3.1 生大黃［17-19］取原藥材除雜，大小分開，清洗干凈，用清水浸泡約六成透，撈出，燜潤到內(nèi)外濕度一致時(shí)，切成片，晾干或烘干，篩去碎屑即可?，F(xiàn)代研究表明，大黃中結(jié)合性大黃酸苷類等瀉下成分煎煮10 min左右，煎出量最高，久煎后多被破壞。故生大黃片用于瀉下時(shí)，應(yīng)后下，且煎煮時(shí)間不宜長(zhǎng)，否則瀉下作用減弱。見圖1。

1.3.2 熟大黃［18，20］將大小分檔的洗凈大黃片用黃酒拌勻，燜潤至黃酒全部被吸盡，放入蒸制容器內(nèi)密閉，置水鍋上武火加熱蒸4～6 h（注意隨時(shí)加水，避免干鍋）至大黃內(nèi)外均呈黑褐色時(shí)取出，曬干或烘干。大黃∶黃酒=100∶0～30。生大黃片經(jīng)蒸熟后，它的瀉下及收斂作用明顯減弱，作用比較緩和；在炮制過程中，產(chǎn)生較多的大黃素等，增強(qiáng)其清熱解毒的作用。臨床上一般用于熱毒引起的火毒瘡瘍等癥。見圖2。

圖2 熟大黃

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件使用Thermo BDS HYPERSIIC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，按照上述條件各組分分離度良好。見圖3。

圖3 大黃混合對(duì)照品及生、熟大黃供試品的HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備1）分別精密稱取蘆薈大黃素12.94 mg，大黃素12.69 mg，大黃酸14.34 mg，大黃酚12.33 mg，大黃素甲醚13.67 mg，分別加入甲醇使之溶解，蘆薈大黃素和大黃素分別定容至25 mL容量瓶中，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚分別定容至10 mL容量瓶中，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。2）分別精密量取蘆薈大黃素和大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，即蘆薈大黃素20.7 μg/mL，大黃酸172.1 μg/mL，大黃素20.3 μg/mL，大黃酚148.0 μg/mL，大黃素甲醚164.0 μg/mL。

2.3 大黃供試品溶液制備分別取大黃不同炮制品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取大黃混合對(duì)照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色譜儀，各進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積，分別以峰面積和進(jìn)樣量（μg）為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。精密吸取上述大黃蒽醌類混合對(duì)照品稀釋液，進(jìn)樣，測(cè)定其信號(hào)（以峰高計(jì)算）與噪聲比值，將S/N=3時(shí)的濃度定為檢測(cè)限（LOD），將S/N=10時(shí)的濃度定為定量限（LOQ）。可得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回歸方程式分別為：Y=5.0×106X-21952（r=0.9999），Y=3.0×106X-352285（r=0.9996），Y=4.0×106X-19323（r=0.9998），Y=6.0×106X-324544（r=0.9999），Y=850954X-64874（r=0.9993）；分別在0.0207～0.414、0.1721～3.442、0.0203～0.406、0.148～2.96、0.164～3.28線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)精密量取混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄各自的峰面積，并計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD（%）。結(jié)果測(cè)得混合對(duì)照品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%，RSD都小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取大黃粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下條件依法測(cè)定各供試品的峰面積，結(jié)果測(cè)得生大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.62%、0.34%、0.29%、0.19%、0.21%；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.93%、0.14%、0.13%、0.19%、0.22%。RSD都小于3.0%，說明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取生大黃和熟大黃藥材粉末0.5 g，精密稱定，每種炮制品均稱取6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件依法測(cè)定各供試品的峰面積，計(jì)算生大黃和熟大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量，結(jié)果測(cè)得生大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚平均含量分別為1.7794、5.1054、2.5204、5.3456、5.8814 mg/g；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均含量分別為1.8396、4.8026、2.6820、6.7914、7.4956 mg/g；生大黃的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的RSD分別為0.54%、0.90%、0.86%、0.54%、1.03%；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚測(cè)的RSD分別為1.35%、0.69%、0.57%、0.80%、0.69%。RSD都小于3.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取大黃藥材粉末0.25g，精密稱定，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.25g藥材含量的80%、100%和120%加樣），每組分別加入混合對(duì)照品溶液（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚），按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算生大黃低、中、高加樣組中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率和其RSD值。結(jié)果見表2—3，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 生大黃加樣試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

表3 熟大黃加樣試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3

2.9 樣品含量測(cè)定分別稱取大黃不同炮制品藥材粉末（過2號(hào)篩）0.5 g，各3份，精密稱定質(zhì)量，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。見表4。

表4 生、熟大黃含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇本試驗(yàn)采用HPLC測(cè)定大黃游離蒽醌，對(duì)其流動(dòng)相進(jìn)行了選擇，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入不同種類的酸對(duì)5種游離蒽醌的分離有很大的影響。本試驗(yàn)采用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%冰醋酸溶液（85∶15）和甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）等流動(dòng)相選擇試驗(yàn)比較，認(rèn)為以甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）作為流動(dòng)相，大黃5種游離蒽醌分離效果較好，與雜峰達(dá)到基線分離。因此認(rèn)為本法快速、重復(fù)性好、穩(wěn)定，可用于大黃炮制原理、工藝、質(zhì)量等研究。

3.2 含量變化分析生大黃用黃酒拌勻，燜潤至黃酒全部被吸盡，放入蒸制容器內(nèi)密閉武火加熱蒸制后，其5種游離蒽醌與生品大黃相比含量有所變化，根據(jù)以上的含量測(cè)定結(jié)果表明，蘆薈大黃素含量下降約8.26%，大黃酸下降約9.21%；而大黃素含量增加約16.44%，大黃酚增加約16.12%，大黃素甲醚增加約20.01%，說明炮制工藝對(duì)中藥大黃各成分影響不相同。熟大黃游離蒽醌類成分比例發(fā)生了變化，根據(jù)熟大黃多年臨床使用證明，這5種游離蒽醌成分比例可能是熟大黃最佳的療效組合，而這種成分比例的變化重新組合，可能是導(dǎo)致其瀉下和收斂作用明顯減弱，作用比較緩和；在炮制過程中，產(chǎn)生較多的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等，增強(qiáng)其清熱解毒的作用。臨床上一般用于熱毒引起的火毒瘡瘍等癥。

3.3 藥理相關(guān)性分析在蒸制的過程中，蒸氣加熱，溫度高，破壞了主要瀉下成分的結(jié)合型大黃酸，使其瀉下作用下降；而大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量增加，可抑制血小板凝集，降低血小板活性，使凝集狀態(tài)得到改善，滲透壓趨于正常。因此，熟大黃相對(duì)于生大黃來說，有更好的活血祛瘀的功效。生大黃經(jīng)炮制后，其藥效發(fā)生了一些改變，治療范圍擴(kuò)大［9，12，21-22］。同時(shí)，經(jīng)過炮制，熟大黃對(duì)胃腸道刺激較生大黃有所下降。不同的中藥炮制方法，產(chǎn)生大黃的不同炮制品，其治療疾病也會(huì)產(chǎn)生差異，所以臨床上要辨證施治，合理使用大黃及其炮制品。