CNV-seq技術(shù)對(duì)1953例自然流產(chǎn)物的染色體數(shù)目和拷貝數(shù)變異分析

項(xiàng)菁 趙伊冉 葛志紅 危薇

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院蘇州九龍醫(yī)院，江蘇蘇州 215028）

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）是妊娠早期常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率為10%～15%［1，2］。發(fā)生胚胎停育及自然流產(chǎn)的原因包括遺傳學(xué)因素、免疫因素、內(nèi)分泌因素及環(huán)境因素等［3-5］。西方學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，約50%早期自然流產(chǎn)的發(fā)生與染色體異常有關(guān)，其中染色三體最常見(jiàn)，其次是三倍體、性染色體單體X、四倍體和染色體結(jié)構(gòu)異常［6］。

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，流產(chǎn)組織物的檢測(cè)方法也不斷更新迭代。傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)雖是染色體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但需細(xì)胞培養(yǎng)，操作復(fù)雜、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，且存在較高失敗風(fēng)險(xiǎn)［7］。熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）雖然解決了細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題，縮短了操作時(shí)長(zhǎng)，但受限于特定熒光探針數(shù)目，不能全面反映流產(chǎn)組織的染色體情況［8］。單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)全基因組覆蓋，但因價(jià)格昂貴未能有效推廣［9，10］。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的應(yīng)用推廣，越來(lái)越多的研究機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)出基于NGS平臺(tái)的染色體異常檢測(cè)技術(shù)。2009年Xie等［11］首次報(bào)道了一種名叫拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNVseq）的技術(shù)，可以在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）。2013年，Shenpei等［12］采用基于CNV-seq的技術(shù)檢測(cè)孕婦血漿中胎兒染色體拷貝數(shù)變異，發(fā)現(xiàn)對(duì)＞10Mb的重復(fù)或缺失的檢測(cè)靈敏度和特異性分別為100%和99.92%。同年Xie等［13］報(bào)道了基于低覆蓋度的CNV-seq技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)48h內(nèi)快速檢測(cè)自然流產(chǎn)組織的非整倍體異常，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)40例流產(chǎn)物的100%準(zhǔn)確檢測(cè)。2015年Liu等［14］采用CNV-seq技術(shù)與核型分析技術(shù)分別對(duì)64例流產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CNV-seq技術(shù)可以檢測(cè)出核型分析無(wú)法分辨的一個(gè)2.58Mb的微小缺失。Cohen等［15］采用CNV-seq技術(shù)對(duì)因樣本質(zhì)量差導(dǎo)致微陣列比較基因組雜交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）檢測(cè)失敗的樣本進(jìn)行檢測(cè)，在9例產(chǎn)前診斷異常的樣本中準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)了致病性CNV，證明了CNV-seq對(duì)于質(zhì)量不好的樣本也可以有效的檢測(cè)。

本文為了進(jìn)一步了解自然流產(chǎn)和染色體異常的相關(guān)關(guān)系，對(duì)近幾年就診于本院及合作單位的自然流產(chǎn)患者，經(jīng)知情同意后采集其流產(chǎn)組織樣本并進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2019年11月間，因自然流產(chǎn)到本院行胚胎染色體檢查的患者共1953例，產(chǎn)婦年齡20～48歲，平均（32.5±5）歲，孕周4～28周，既往流產(chǎn)次數(shù)0～5次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本準(zhǔn)備 采集黃豆粒大?。?00mg）流產(chǎn)組織，生理鹽水充分清洗后置于無(wú)菌采樣管中凍存（-20℃暫存）。使用QIAamp DNeasy Blood&Tissue Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行流產(chǎn)組織基因組DNA提取，要求提取DNA總量＞500ng，濃度＞20ng／μl。

1.2.2 檢測(cè)方法 參考文獻(xiàn)［13］采用酶切法進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建：使用片段化酶將基因組DNA隨機(jī)打斷，末端修復(fù)和d A尾添加后，在其兩端加上含特定標(biāo)簽序列的測(cè)序接頭，PCR擴(kuò)增放大后獲得測(cè)序文庫(kù)，使用Qubit dsDNA HS Assay kit（Invitrogen）試劑盒進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢定量。定量合格后的文庫(kù)在Illumina Hiseq2000高通量測(cè)序儀上進(jìn)行PE100測(cè)序，保證每個(gè)樣本的檢測(cè)有效讀段（Reads）數(shù)＞2M。然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，把測(cè)序得到的每個(gè)DNA片段序列定位到人類(lèi)基因組參考序列（GRCh37／hg19）上，去除低質(zhì)量的堿基序列后使用環(huán)狀二元分割算法（circular binary segmentation，CBS）進(jìn)行拷貝數(shù)分析，通過(guò)Z檢驗(yàn)查找發(fā)生染色體片段變異的可靠性，最終獲得人23對(duì)染色體上的CNV情況。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)組織染色體異常率及非整倍體分布1953例流產(chǎn)組織樣本中，1013例存在染色體異常，異常率為51.87%，其中以染色體非整倍體最常見(jiàn)，共有870例，發(fā)生率為44.55%（870／1953），占異常核型的85.88%（870／1013），涉及除1號(hào)染色體外的所有染色體，以16-三體發(fā)生頻率最高，其次為22-三體、X單體15-三體和21-三體。涉及13、15、16、21、22、X號(hào)染色體的非整倍體異常共612例，占所有非整倍體異常的70.34%（612／870）。染色體13、14、15、16、21、22、X中，非整倍體異常占染色體異常比例的90%以上；1號(hào)染色體均為拷貝數(shù)變異，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非整倍體異常；7、9、11號(hào)染色體非整倍體異常占比偏低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在染色體異常樣本中存在多重染色體異常情況，有110例樣本存在多重染色體異常，發(fā)生率10.86%（110／1013）；有65例樣本存在多重非整倍體異常，發(fā)生率7.47%（65／870）。詳細(xì)數(shù)據(jù)參表1、圖1。

圖1 染色體異常和非整倍體在各染色體上的分布情況（含多重）

表1 流產(chǎn)組織染色體異常結(jié)果分析

同時(shí)，我們也單獨(dú)分析了1013例染色體異常樣本中各種變異類(lèi)型的分布情況（表2），染色體三體最多（61.11%），其次為嵌合三體（14.12%），單體（9.77%）；微重復(fù)和微缺失樣本數(shù)目略高于重復(fù)和缺失，分別占比4.64%和3.16%；最少的為嵌合單體，僅發(fā)現(xiàn)10例（0.99%）。

表2 染色體異常樣本中各種變異類(lèi)型分布情況

2.2 孕婦年齡、孕周、既往流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常關(guān)系 本次研究發(fā)現(xiàn)孕婦年齡≥35歲組胚胎染色體異常率明顯高于年齡＜35歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（56.57%vs.42.17%，P＜0.05）（見(jiàn)表3）；早期自然流產(chǎn)（孕周＜12周）的胚胎染色體異常率明顯高于中晚期自然流產(chǎn)（孕周≥12周），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（58.76vs.23.21%，P＜0.01）（見(jiàn)表4）；而產(chǎn)婦既往流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體的異常率關(guān)系不大（P＞0.05）（表5）。

表3 孕婦年齡與染色體異常發(fā)生率間的關(guān)系

表4 孕婦流產(chǎn)孕周與染色體異常發(fā)生率間的關(guān)系

表5 孕婦流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常發(fā)生率間的關(guān)系

3 討論

自然流產(chǎn)是指妊娠周數(shù)不足28周，胎兒體重低于1kg自發(fā)出現(xiàn)的妊娠終止，發(fā)病率約10%～15%，多為孕早期自然流產(chǎn)（12周內(nèi)）。傳統(tǒng)核型分析是染色體疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其分辨率低，僅能檢測(cè)約10Mb以上的重復(fù)和缺失。研究表明，常規(guī)G顯帶核型分析認(rèn)為核型正常的細(xì)胞中還存在各種類(lèi)型的CNVs［16，17］，如Liu等［18］使用CNV-seq技術(shù)檢測(cè)出了G顯帶核型分析漏檢的嵌合和一個(gè)2.58Mb的微缺失。自1995年起，aCGH技術(shù)逐漸應(yīng)用于流產(chǎn)組織遺傳學(xué)檢測(cè)，并取得了很好的臨床效果［19］。近年，隨著CNV-seq技術(shù)的誕生，很多學(xué)者將兩種技術(shù)做了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CNV-seq和aCGH的檢測(cè)一致性近乎100%［20］，且能夠檢測(cè)出許多aCGH技術(shù)無(wú)法分辨的拷貝數(shù)變異。

本文基于CNV-seq技術(shù)對(duì)1953例流產(chǎn)組織樣本進(jìn)行的遺傳學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，51.87%存在染色體異常，其中85.88%為染色體非整倍體異常，涉及除1號(hào)染色體外的所有染色體，以16-三體發(fā)生頻率最高，其次為22-三體、X單體15-三體和21-三體。

通過(guò)CNV-seq技術(shù)分析流產(chǎn)組織染色體畸變是否存在，如結(jié)果無(wú)異常時(shí)，可基本排除遺傳畸變影響，從而考慮精子畸形、免疫、感染環(huán)境等因素。如染色體畸變?yōu)榉钦扼w異常，多是生殖細(xì)胞發(fā)育或受精卵卵裂過(guò)程中，染色體不分離或丟失等原因所致。如染色體畸變?yōu)槿笔Щ蛑貜?fù)，則需進(jìn)一步分析是新發(fā)變異還是遺傳，夫妻雙方均需行CNV-seq檢測(cè)以分析CNV多態(tài)性影響。在人類(lèi)基因組中大約有4.8%～9.5%區(qū)域?yàn)镃NV，其中99%以上屬于良性變異即多態(tài)性，但另外1%的CNVs會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的染色體疾?。?1］。根據(jù)最新CNV指南［22］，CNV可分為5類(lèi)：致病、可能致病、臨床意義不明、可能良性、良性。當(dāng)出現(xiàn)臨床意義未知CNV時(shí)，通常采用的方法是進(jìn)行親代驗(yàn)證，以明確哪些是存在于雙親中而無(wú)明顯臨床表現(xiàn)的變異，哪些是新發(fā)突變。本研究共發(fā)現(xiàn)152例（占染色體異常比例為15.02%）流產(chǎn)組織中存在缺失和重復(fù)（含嵌合），查證Clinvar、DGV、DECIPER等數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)約30%有明確致病描述，約20%為可能致病，良性或可能良性的很少（＜5%）。其中未見(jiàn)報(bào)道的CNV異常有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證，包括收集夫妻雙方血樣進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)等。

本次研究還發(fā)現(xiàn)孕婦年齡≥35歲組胚胎染色體異常率明顯高于年齡＜35歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（56.57%vs.42.17%，P＜0.05）；早期自然流產(chǎn)（孕周＜12周）的胚胎染色體異常率明顯高于中晚期自然流產(chǎn)（孕周≥12周），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（58.76%vs.23.21%，P＜0.01）；而產(chǎn)婦既往流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體的異常率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究的結(jié)果印證了母親年齡增長(zhǎng)和胚胎染色體異常發(fā)生率升高具有相關(guān)性，提示高齡人群應(yīng)更注重胎兒染色體檢查。對(duì)于自然流產(chǎn)尤其早期自然流產(chǎn)者，借助CNV-seq技術(shù)的檢測(cè)，可有助于判知流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因，評(píng)估再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)后期的生育指導(dǎo)提供重要的遺傳咨詢(xún)信息。