無創(chuàng)單基因病的研究進(jìn)展

胡聽聽 綜述王繼成 校審

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東廣州 510010）

1997 年，Lo等［1］證實了母體外周血胎兒游離DNA（cell-freefetal DNA，cff-DNA）可以診斷胎兒遺傳性疾病。最近的臨床研究也證實，在單胎妊娠中使用無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）檢測21、18、13-三體比傳統(tǒng)的篩查方案具有更低的假陽性和更高的陽性預(yù)測值［2］。隨后，各種方法如雨后春筍一樣不斷出現(xiàn)。如今，可以在母體外周血中發(fā)現(xiàn)全部的胎兒基因組［3，4］，這也是各種胎兒遺傳性疾病可以通過母體外周血檢測的基礎(chǔ)。

產(chǎn)前診斷是通過各種方法檢測和監(jiān)測胎兒生長發(fā)育狀況，檢測方法分為有創(chuàng)和無創(chuàng)。傳統(tǒng)有創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法是在血清學(xué)檢查或超聲診斷中發(fā)現(xiàn)胎兒可能存在生長發(fā)育異常狀況，進(jìn)一步對胎兒染色體進(jìn)行檢測，包括羊水穿刺、絨毛穿刺、臍血穿刺等胎兒細(xì)胞學(xué)檢查。這些穿刺檢測方法不僅會造成大約1%的流產(chǎn)率，也會對胎兒和母體造成傷害［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，在孕5周時，孕婦外周血就可以穩(wěn)定地檢測到cff-DNA［6］，這樣可以在早期即可監(jiān)測胎兒遺傳發(fā)育狀態(tài)。通過提早檢測胎兒遺傳性疾病，可以盡早進(jìn)行終止妊娠，避免對孕婦產(chǎn)生更多傷害。有研究表明，cff-DNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，高度片段化，在胎兒出生后就從母血中完全清除了，一般不會影響下一胎的檢測［7］。

現(xiàn)階段應(yīng)用于臨床的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷主要是檢測胎兒21、18、13和性染色體異常以及血型RHD基因的檢測［2］。隨著胎兒全基因組游離DNA的發(fā)現(xiàn)，單基因病檢測成為下一個需要解決的難題。由于孕婦外周血中存在大量孕婦游離DNA，cff-DNA大約只占10%～15%［8］，對單基因的檢測造成干擾，且需要獲取父母或先證者的基因型構(gòu)建胎兒基因型，從而推測胎兒單基因病遺傳狀況，所以現(xiàn)階段無創(chuàng)產(chǎn)前單基因病檢測還處于實驗探索階段。經(jīng)過多年的技術(shù)和研究方法的改進(jìn)，無創(chuàng)產(chǎn)前單基因病檢測取得了長足的發(fā)展，本綜述即以此發(fā)展作為主題，論述近幾年單基因無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的發(fā)展?fàn)顩r。

1 無創(chuàng)單基因病

單基因病又名孟德爾遺傳病，從OMIM數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／omim）可查的單基因病大約有8000多種，平均每個人攜帶2.8個隱性遺傳病致病突變。在無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒單基因病檢測中，由于需要先證者和父母雙方的基因型，對于沒有臨床表型并且沒有先證者的家庭，或者對于難以發(fā)現(xiàn)的隱性單基因遺傳病的家庭，進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前單基因檢測很困難。隨著技術(shù)的發(fā)展和方法學(xué)的改進(jìn)，很多胎兒的遺傳病現(xiàn)在都可以通過各種方法檢測出，包括常染色體顯性、隱性遺傳病，比如α／β地中海貧血、遺傳性腎上腺增生、軟骨發(fā)育不全、囊性纖維化等。單基因遺傳特點見表1。

表1 單基因病遺傳特點

外周血中90%是母體DNA［4］，通過檢測母體外周血中胎兒新發(fā)突變和父方突變，可以間接獲取胎兒單基因病攜帶狀況。但是暫時還沒有一種方法能直接獲得母體外周血中胎兒全部基因組DNA，故多數(shù)研究都停留在試驗階段。現(xiàn)有的技術(shù)或方法都旨在提高母血中cff-DNA的檢測質(zhì)量，提高疾病檢測的靈敏度和特異度。這些方法包括基本的分子生物學(xué)檢測技術(shù)和新發(fā)展的下代測序技術(shù)或單分子測序技術(shù)等，對于不同的疾病需使用不同的方法。而臨床應(yīng)用則需要檢測方法操作簡單、結(jié)果可靠、檢測時間短，以及檢測費(fèi)用低廉。

3 常見無創(chuàng)單基因病檢測方法和技術(shù)

母血血漿中胎兒DNA濃度非常低，且大多屬于小片段（大多數(shù)是小于200bp）［8］，需要合適的提取方法和分析方法檢測胎兒DNA。常見的提取方法有磁珠提取法和柱提法。柱提法有QIAamp DNA Blood Mini Kit或者TIANamp Micro DNA Kit等，常用的檢測技術(shù)方法見表2。

表2 常用檢測技術(shù)和方法

這些方法（見表2）中測序技術(shù)包括一代sanger測序，比如ABI3500測序平臺；二代循環(huán)芯片測序法（cyclic-array sequencing），比如Roche454、Illumina Miseq、Ion Torrent等測序平臺；三代測序單分子測序，比如Heliscope等測序平臺。通過這些技術(shù)方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)分析，可以得到胎兒的遺傳學(xué)信息。分析方法主要有直接檢測法，比如檢測Y染色體異常突變；相對突變劑量法（relative mutation dosage，RMD），通過檢測血漿DNA中相對突變劑量進(jìn)行突變位點分析，主要針對常染色體顯性遺傳病，比如血友病、Rh D基因檢測；相對單體劑量法（relative haplotype dosage analysis，RHDO），多用于單基因病的檢測，主要使用單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）連鎖分析獲得胎兒的單體型，從而推測胎兒的等位基因突變點。Lo等［3］在一篇文章中提到，在單體型等位基因檢測方面RHDO優(yōu)于RMD，并且分析方法也更為準(zhǔn)確可靠。RHDO方法主要從下面幾個方面檢測出胎兒遺傳單體型等位基因：首先通過對父母雙方和先證者進(jìn)行SNP位點檢測，獲得所需的SNP位點信息，然后進(jìn)行外周血cff-DNA檢測，再通過RHDO分析計算cff-DNA等位SNP位點比率，推測出胎兒遺傳自父母的單體型。若檢測遺傳自父方單體型，則選取父方為雜合母方為純合的SNP位點構(gòu)建胎兒單體型；檢測母方遺傳的胎兒單體型，則需要選取母方為雜合父方為純合的SNP位點，再通過相對劑量計算就可以得出胎兒單體型。這種方法選取的SNP位點越多得到的結(jié)果也就越可靠準(zhǔn)確，但也需要平衡檢測費(fèi)用等。

RHDO存在的問題是如何獲得cff-DNA所占母體游離DNA的比例。由于個體差異，cff-DNA的量易受孕婦孕周、體重等影響，不容易確定。對于男嬰可以通過Y染色體確定cff-DNA比例，比如選取Y染色體上的SRY基因進(jìn)行熒光定量PCR。然而對于女嬰，由于很難選取與母體差異的標(biāo)志基因，故很難進(jìn)行定量。一種方法是經(jīng)過大規(guī)模人群篩選，確定160bp的片段大多來源于胎兒DNA，故通過測定該片段的量可以確定cff-DNA的量；另一種方法是選取母體和胎兒差異表達(dá)的基因進(jìn)行相對定量。一項研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因在母體中是低甲基化的，而在胎盤中是高甲基化的，通過限制酶對低表達(dá)的母血DNA消化，然后對胎兒特異的RASSF1A高甲基化基因進(jìn)行熒光定量PCR測定，則可確定cff-DNA的量［9，10］。Lam等［11］在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷beta地中海貧血研究中使用6號染色體上的父母均為純合的SNP位點獲得胎兒cff-DNA所占比例，該方法的方程式為f＝∑2p／∑（p＋q）（其中p是父方遺傳的cff-DNA數(shù)量，q是母方和母方遺傳的cff-DNA數(shù)量，f是cff-DNA所占比例）。

一項由Hui和Lo等［12］參與的研究證實通過RHDO方法可以檢測大多數(shù)單基因病。他們使用10Xgenomic公司的Linked read技術(shù)，結(jié)合二代測序，對13個家庭進(jìn)行RHDO分析，包括Beta地中海貧血、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥和血友病。該研究團(tuán)隊先對13個家庭的父母單倍型進(jìn)行分析，確定所需的的SNP位點，然后通過測序檢測母血中短片段游離DNA，通過RHDO分析胎兒突變圖譜，確定胎兒單基因病遺傳突變情況。由于該方法成本高，暫不適用于臨床。

4 常見單基因病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（表3）

表3 常見單基因病的無創(chuàng)檢測

4.1 杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝氏肌營養(yǎng)不良（Beckermuscular dystrophy，BMD） DMD是一種X-連鎖隱性遺傳性肌病，典型臨床特征以進(jìn)行性肌萎縮無力伴小腿腓腸肌假性肥大為主。在人群中一般3～5歲發(fā)病，20歲左右便發(fā)病死亡，在存活的男嬰中其發(fā)病率為1／3600～1／6000［27］。BMD發(fā)病率略低，大概1／18 000，具有DMD相似的臨床特征，但病情較輕。DMD基因至少含有79個外顯子，位于Xp21.2，長度大約為2.4Mb。約70%DMD患者存在1個或多個外顯子大片段缺失或重復(fù)，剩余約30%可能是點突變、小的插入缺失、復(fù)雜的微小重排等。Xu等［13］的1項對8個家庭的研究提出無創(chuàng)產(chǎn)前診斷可以應(yīng)用于檢測DMD。這8個家庭的孕婦都是DMD攜帶者，孕期分布為17～22周，他們首先通過目標(biāo)測序檢測出父方、母方和先證者的單體型，選取SNP位點進(jìn)行探針設(shè)計。這些探針在X染色體上隨機(jī)分布，包括1.66M的外顯子區(qū)域和39 319個高度雜合的SNP位點，其中1243個SNP位點是在DMD基因區(qū)域。cff-DNA濃度通過選取父母SNP為純合的位點，22號染色體為雜合的SNP位點進(jìn)行檢測，濃度差別大概在3.52%～22.67%之間。外周血游離DNA使用Illumina Hiseq2000檢測，目標(biāo)區(qū)域測序深度為36.4，覆蓋度為95.23%，然后通過隱馬爾科夫模型隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM）推測胎兒單體型。該方法得出的結(jié)果和有創(chuàng)絨毛膜穿刺結(jié)果一致，但由于檢測費(fèi)用高，易受游離胎兒DNA濃度和胎兒染色體重組的影響，故暫時還未進(jìn)入臨床應(yīng)用。

英國伯明翰婦女醫(yī)院遺傳實驗室Michael團(tuán)隊招募了2個研究組對無創(chuàng)產(chǎn)前檢測DMD進(jìn)行研究，一組是已經(jīng)通過有創(chuàng)檢測出非整倍體高風(fēng)險孕婦，另一組是已知孕婦是DMD／BMD攜帶者［28］。由于DMD／BMD是X連鎖遺傳病，所以只需要通過母親單體型和先證者單體型確定SNP位點進(jìn)行檢測分析。對孕婦外周血游離DNA進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序檢測后，通過RHDO分析，獲得胎兒單體型。目標(biāo)探針檢測區(qū)域包括1350個SNP位點，位于該基因的2.4Mb范圍內(nèi)（Chr X：31037731-33457670）。結(jié)果顯示除了2個家庭游離DNA過低（低于4%）無法做進(jìn)一步檢測，其他結(jié)果都和有創(chuàng)檢測結(jié)果一致。同時該團(tuán)隊提到需要設(shè)計更多的探針檢測基因上下游非編碼區(qū)，因為這些調(diào)控區(qū)域也可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。最后他們談到可以建立探針數(shù)據(jù)庫和通過檢測多種疾病完善方法來降低檢測費(fèi)用。

4.2 脊髓性肌萎縮不良（spinal muscular atrophy，SMA） SMA是一種常染色體隱性遺傳疾病，發(fā)病率約為1／6000～1／10 000。這種病在2歲以下小孩致死率很高，給家庭帶來巨大痛苦和負(fù)擔(dān)。約95%的病人主要由于SMN1基因中的7、8號外顯子缺失。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過絨毛或羊水穿刺獲取胎兒DNA，使用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、QF-PCR、DHPLC等方法檢測。2015年Chen［29］團(tuán)隊的一項研究表明可以通過無創(chuàng)方法檢測胎兒SMA基因突變。該研究團(tuán)隊招募了5個SMA攜帶者家庭，使用目標(biāo)捕獲測序法對SMN1基因的28Kb編碼序列和該基因上下3M區(qū)域的2011個SNP位點進(jìn)行測序，然后通過父母、先證者三方的SNP位點進(jìn)行分析，最后的結(jié)果和侵入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果完全一致。該研究證明該方法的可靠性較高，但受測序深度、SNP位點信息和目標(biāo)區(qū)域GC含量的影響，導(dǎo)致該方法敏感性低。

Parks［17］的團(tuán)隊使用目標(biāo)捕獲測序法合并RHDO方法從父方、母方和先證者的SNP連鎖分析的到胎兒單體型，檢測胎兒SMA。他們選取了位于5號染色體13.2區(qū)域的包括SMA1和SMA2基因的6Mb區(qū)域共3039個SNP位點，這些位點雜合率大于40%。檢測分析了13個家系，靈敏度和特異度為100%，單體型SNP分型的準(zhǔn)確度為99.43%。該方法的缺點為無法檢測嵌合的家系、新發(fā)突變、異卵雙胞胎、器官移植和沒有先證者的家系。若使用該方法對雙胎消失之一的孕婦和SMA基因高度重復(fù)序列重組難以設(shè)計探針的區(qū)域的家系進(jìn)行檢測，可能會導(dǎo)致誤診。該方法可以在孕初期進(jìn)行檢測，而不影響后續(xù)的妊娠監(jiān)測。

4.3 地中海貧血 地中海貧血是遺傳突變導(dǎo)致珠蛋白合成障礙或缺乏的一種血液疾病，表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血，嚴(yán)重者需要終生輸血，甚至胎死宮內(nèi)。針對地中海貧血，現(xiàn)有的產(chǎn)前檢測手段為絨毛檢測、羊水穿刺或臍血穿刺，這可能會導(dǎo)致胎兒畸形、死亡或?qū)m內(nèi)感染。Lam等［11］使用了目標(biāo)捕獲測序結(jié)合RHDO分析檢測β地中海貧血，對每個家庭都需要重新設(shè)計SNP位點，但如若父母有親緣關(guān)系則很難選擇SNP位點。該研究對于已知點突變且容易直接從孕婦外周血游離DNA獲取突變型，則可以使用RMD，這樣根據(jù)不同的情況選擇這兩種方法，更經(jīng)濟(jì)有效。南方醫(yī)科大學(xué)的Yan等［15］在2011年發(fā)表的文章中指出，可以對α0型地中海貧血（--SEA、--FIL和--THAI）缺失部位尋找SNP位點，排除父方遺傳的α0型，可以使一半的孕婦免受有創(chuàng)檢測。常見的β地中海貧血大多都是HBB基因點突變引起的，α地中海貧血大多由相關(guān)基因缺失引起。桂林醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的優(yōu)生遺傳實驗室嘗試通過孕婦外周血cff-DNA來檢測α和β地中海貧血，這給地中海貧血攜帶者孕婦帶來希望［15］。他們使用的是目標(biāo)捕獲測序結(jié)合RHDO分析，捕獲探針包含3.7Mb的目標(biāo)區(qū)域，包括HBA1、HBA2和HBB基因突變區(qū)域。首先通過目標(biāo)捕獲測序檢測父母和先證者的單體型，然后測序母體外周血游離DNA，分析其單體型組成，推測胎兒單體型，最后獲得胎兒遺傳突變位點。他們招募了2個家庭進(jìn)行研究，一個家庭是CD17（A＞T）的母親和CD41-42（-TTCT）的父親，另一個家庭夫妻雙方都是SEA雜合缺失。該研究和之前的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測地中海貧血的新穎點在于他們使用了目標(biāo)區(qū)域高度雜合的SNP位點，這樣減少了目標(biāo)區(qū)域的范圍，進(jìn)而減少了測序深度，降低了成本，同時區(qū)域限制在小范圍可以減少重組導(dǎo)致的誤差。

4.4 囊性纖維化 囊性纖維化是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳病，由于外分泌腺異常導(dǎo)致慢性梗阻性肺病、消化系統(tǒng)疾病等，患有該病的半數(shù)兒童因感染或心肺衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。在活嬰中發(fā)病率為1／2500～1／3500，攜帶率大約為1／25。Hill［22］的研究團(tuán)隊招募了囊性纖維化基因CFTR突變攜帶者的孕婦，首先建立一個CFTR突變基因相關(guān)的二代測序Panel，通過測序方法檢測CFTR基因附近的多個SNP位點，然后使用RMD分析胎兒基因型。這種方法可以同時檢測不同的家庭、不同的突變點和一些其他的不同的情況。和全基因組測序、目標(biāo)捕獲測序等方法相比這種方法具有實效性、時間短、花費(fèi)少。他們同時還提出在確保準(zhǔn)確、安全、有效的情況下，應(yīng)該站在孕婦角度，從實用和經(jīng)濟(jì)角度考慮，這些研究才更有意義。另一項研究針對具有囊性纖維化或SMA高風(fēng)險的63個孕婦家庭，進(jìn)行多種方法組合檢測［26］。他們首先從孕婦外周血細(xì)胞中有核細(xì)胞進(jìn)行HE染色，分離大于15um的滋養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后使用短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）方法檢測胎兒遺傳突變。該方法比起其他檢測cff-DNA更為直接，實驗若設(shè)計合理則可以的到可靠的結(jié)果，這也給未來無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal scanning，NIPS）帶來一個新的發(fā)展方向。

5 結(jié)語

通過方法和策略的選擇，我們已經(jīng)能夠檢測很多的已知的單基因遺傳病。雖然母體外周血中cff-DNA濃度很低，但檢測靈敏度不斷提高，4%左右的cff-DNA濃度已經(jīng)能應(yīng)用到胎兒遺傳病的檢測。從cff-DNA的發(fā)現(xiàn)，到非整倍體檢測的成熟，到現(xiàn)在胎兒基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等各方面開花。通過基因組學(xué)，我們不僅可以知曉胎兒非整倍體情況，也可以獲取胎兒微缺失／微重復(fù)的狀況［30］；通過表觀遺傳學(xué)，我們可以追蹤胎兒生長發(fā)育狀況，甚至通過對胎兒疾病早期干預(yù)，達(dá)到治療的目的［31］；通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)，可以更加深刻地認(rèn)識表達(dá)調(diào)控等信息［32］。隨著非整倍體在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用，將會有越來越多的遺傳性疾病在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中應(yīng)用，相信隨著研究的深入，對胎兒疾病的干預(yù)治療等也會隨著胎兒遺傳物質(zhì)的研究而發(fā)展。但是面對基因重組、嵌合體、雙胎妊娠等還沒有一個好的解決方案；對于新發(fā)突變，需要不斷地改進(jìn)方法。另一方面，單基因病只占全部遺傳性疾病的少部分，應(yīng)用于臨床則需要考慮費(fèi)用，現(xiàn)今的NIPS檢測方法大多費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)錢，也需要不斷改進(jìn)?，F(xiàn)階段通過加大測序深度，大多數(shù)單基因病或新發(fā)突變都能通過適當(dāng)分析得到，但這些方法和策略面對不同疾病類型就需要不斷更換，不斷重新設(shè)計，比如SNP位點的選擇，使檢測成本大幅提升。不過隨著研究的方法深入，獲得的信息越來越多，技術(shù)越來越成熟，測序成本越來越低，相信不久的將來無創(chuàng)產(chǎn)前單基因病也會成為一個臨床常規(guī)項目。