黏連蛋白維持基因組結(jié)構(gòu)分子機制研究進展

史竹兵，白曉辰，于洪濤③?

①得克薩斯大學 西南醫(yī)學中心藥理學系，美國得克薩斯州 達拉斯市 75390；②得克薩斯大學 西南醫(yī)學中心生物物理學系和細胞生物學系，美國得克薩斯州 達拉斯市 75390；③西湖大學 生命科學學院，杭州 310024

生命體通過傳遞遺傳物質(zhì)給下一代進行繁殖，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核苷酸（DNA）是生命體的遺傳信息儲存載體。單個細胞內(nèi)的所有DNA組成了有機體的基因組。不同類型生命體的基因組大小差異顯著。細菌的基因組大小在60萬～800萬堿基對之間，單細胞生物釀酒酵母的基因組大小約為1 350萬堿基對，而高等動物人類的雙倍體基因組約為64億堿基對，總長度達到2 m。真核生物的基因組主要包含在細胞核里，而細胞核的大小一般小于10 μm。如何將宏觀尺度的基因組包裝入微米級的細胞核中，是生命科學的基本問題之一。

在細胞中，基因組的組織不是雜亂無章的，而是形成特定的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。組蛋白結(jié)合DNA從而形成核小體結(jié)構(gòu)，并被進一步包裹成染色質(zhì)。真核生物通過細胞周期來完成自我增殖?；蚪M在細胞周期的兩個不同時期——分裂間期和分裂期——具有不同的形態(tài)。在細胞分裂間期，基因組形成纖維樣結(jié)構(gòu)[1]；而在細胞分裂期，染色體高度聚縮形成X形。一類被命名為染色體結(jié)構(gòu)維持（SMC）的蛋白質(zhì)復(fù)合物對于維持基因組結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。在脊椎動物中，兩類SMC復(fù)合物——黏連蛋白（cohesin）和凝縮蛋白（condensin）——分別調(diào)控細胞分裂間期和分裂期的基因組結(jié)構(gòu)[2-5]。黏連蛋白同時介導細胞周期中姐妹染色單體黏連，與凝縮蛋白一起保證了細胞分裂中染色體的正確分離[6-9]。黏連蛋白相關(guān)的研究一直是基因組生物學的重點領(lǐng)域。近幾年的突破性科學發(fā)現(xiàn)正慢慢揭開黏連蛋白的神秘面紗。

1 姐妹染色單體衛(wèi)士——黏連蛋白

在20世紀90年代， Kim A. Nasmyth以及Douglas Koshland等研究組先驅(qū)性的工作發(fā)現(xiàn)了黏連蛋白的主要組分在姐妹染色體黏連中的重要作用[10-14]。1999年，Kim A. Nasmyth研究組率先鑒定出酵母黏連蛋白的四個主要亞基，分別為SMC1、SMC3、SCC1（也被稱為RAD21或MCD1）以及SCC3[14]。2000年，Jan-Michael Peters和Tatsuya Hirano研究組完成了脊椎動物，包括人類黏連蛋白的鑒定工作[15-16]。在脊椎動物體細胞中，SCC3有兩個同源蛋白，分別命名為STAG1和STAG2。隨后，SCC2、SCC4、PDS5、WAPL以及ECO1等對黏連蛋白起重要調(diào)控作用的蛋白也逐一展現(xiàn)在人們的眼前。

在脊椎動物細胞期末期，或者在酵母細胞G1期，黏連蛋白在SCC2-SCC4（在脊椎動物中被命名為NIPBL-MAU2）裝載復(fù)合物的幫助下加載到染色質(zhì)上[17]。反之，釋放因子WAPL在PDS5的介導下促進黏連蛋白從染色質(zhì)上釋放下來[18-22]（圖1（a））。在S期，伴隨著DNA的復(fù)制，姐妹染色單體被黏連蛋白黏連在一起[23]。乙?；D(zhuǎn)移酶ECO1在DNA復(fù)制過程中被招募到復(fù)制機器上并乙?；疭MC3[24-27]。SMC3乙?；种起みB蛋白的活性，拮抗WAPL-PDS5復(fù)合物的功能，從而使得部分黏連蛋白穩(wěn)定地定位于染色質(zhì)上。PDS5又可以增強SMC3的乙?；?，促進黏連蛋白在染色質(zhì)上滯留[28]。在哺乳動物細胞中，sororin通過直接與WAPL競爭結(jié)合PDS5并抑制WAPL的作用來幫助黏連蛋白與染色質(zhì)結(jié)合[29]。在細胞分裂期前期，包括Aurora B、CDK1和PLK1在內(nèi)的對細胞周期起調(diào)控作用的蛋白激酶磷酸化sororin和STAG1/2，解除了對WAPL-PDS5的抑制作用，從而促進位于染色體臂上的大部分黏連蛋白解離[15,30-32]。這一“前期途徑”（prophase pathway）目前僅在后生動物中被發(fā)現(xiàn)。在著絲粒區(qū)域，shugoshin結(jié)合STAG1/2并招募磷酸酶PP2A，通過去磷酸化sororin和STAG1/2來保護黏連蛋白，使之免于被WAPL-PDS5解離[33-34]。

圖1 黏連蛋白介導基因組折疊與姐妹染色體黏連。（a）黏連蛋白在SCC2-SCC4裝載復(fù)合物的幫助下加載到染色質(zhì)上。伴隨著DNA復(fù)制，黏連蛋白將姐妹染色單體黏連在一起。（b）黏連蛋白通過環(huán)擠壓方式壓縮基因組，而CTCF限制該環(huán)擠壓過程。黏連蛋白與CTCF一起介導細胞周期間期染色質(zhì)環(huán)和拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域的形成

當細胞從細胞周期中期向后期過渡時，泛素連接酶后期促進復(fù)合物/細胞周期體（APC/C）泛素化分離酶抑制蛋白（securin），導致其降解[35-37]。激活的分離酶（separase）可以切割SCC1，使得黏連蛋白從染色體上解離下來，引起姐妹染色單體分離[38-41]。姐妹染色單體的正常分離是細胞周期正常運行的前提條件。染色單體分離異常將導致非整倍性，從而引起細胞凋亡以及疾病發(fā)生[42-43]。因此，黏連蛋白的精確調(diào)控確保了有絲分裂中基因組的穩(wěn)定性。

2 黏連蛋白如何折疊哺乳動物基因組？

真核生物基因組構(gòu)象極具復(fù)雜性并高度動態(tài)。近年來，借助于高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，高維度染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）成為研究基因組構(gòu)象的重要工具，該技術(shù)在染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（3C）基礎(chǔ)上開發(fā)而來。Hi-C數(shù)據(jù)顯示人類細胞的基因組形成兆堿基對尺度的區(qū)室（compartment）[44]，不同區(qū)室對應(yīng)著不同的染色質(zhì)活性狀態(tài)：A和B區(qū)室分別具有開放、活性和關(guān)閉、非活性狀態(tài)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。區(qū)室進一步可分為不同的亞區(qū)室（subcompartment）結(jié)構(gòu)[45]。區(qū)室結(jié)構(gòu)與特異蛋白包括HP1α介導的相分離相關(guān)[46]。拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域（topologically associating domain, TAD）和染色質(zhì)環(huán)（loop）是亞兆堿基對尺度的染色質(zhì)組織方式[45,47-48]。染色質(zhì)絕緣蛋白CTCF定位于染色質(zhì)環(huán)和拓撲關(guān)聯(lián)域的邊界[45,49]（圖1（b））。在黏連蛋白釋放因子WAPL或PDS5敲除細胞中，染色質(zhì)高度聚縮成“細面條”樣形態(tài)[18,50]，暗示黏連蛋白在染色質(zhì)壓縮過程中也起著關(guān)鍵作用。事實上，誘導黏連蛋白亞基RAD21或其裝載復(fù)合物降解削弱甚至瓦解了拓撲關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)環(huán)[51-53]，而去除細胞中的WAPL或PDS5導致相反的作用[52,54]。

早在2001年，Kim A. Nasmyth提出環(huán)擠壓（loop extrusion）模型來解釋染色質(zhì)壓縮過程[55]（圖1（b））。該模型認為：ATP驅(qū)動的分子機器——環(huán)擠壓器（如黏連蛋白），首先通過其上兩個位點結(jié)合DNA，形成小的染色質(zhì)環(huán)[55-56]；接著，該分子機器依賴于ATP水解在DNA上移動，擠壓形成大的染色質(zhì)環(huán)；最終，染色質(zhì)環(huán)的邊界元素（如CTCF結(jié)合位點）將該分子機器制止在基因組上的特定位置，完成染色質(zhì)的壓縮過程。該模型與大量的實驗證據(jù)以及分子動力學模擬結(jié)果相吻合[57-60]，合理地解釋了黏連蛋白和CTCF在染色質(zhì)壓縮中的特異功能，以及為什么錨定染色質(zhì)環(huán)和拓撲關(guān)聯(lián)域邊界的一對CTCF結(jié)合位點傾向于會聚的取向[45,49,58,61-62]。然而，黏連蛋白介導的環(huán)擠壓功能直至最近才被證實。2019年，Jan-Michael Peters研究組和筆者研究組相互獨立地利用單分子成像技術(shù)實時觀測到黏連蛋白介導的環(huán)擠壓過程[63-64]。該過程需要裝載蛋白的幫助，并依賴于ATP的水解。與壓縮DNA的速率類似，黏連蛋白介導的環(huán)擠壓過程的平均速率可

達到0.5～1 kb/s。除了壓縮裸露的DNA，筆者研究組觀測到黏連蛋白也能夠以同樣速率壓縮核小體包裹的DNA分子。與之前報道的凝縮蛋白介導的不對稱環(huán)擠壓過程[65]不同的是，單分子成像顯示黏連蛋白雙側(cè)同時壓縮DNA，形成對稱的DNA環(huán)結(jié)構(gòu)。黏連蛋白被認為以兩種方式結(jié)合DNA，分別是拓撲和非拓撲形式。黏連蛋白以拓撲形式結(jié)合DNA來介導姐妹染色單體黏連，但是以非拓撲結(jié)合形式來執(zhí)行DNA壓縮過程[63-64,66-67]。對于黏連蛋白是以單體還是以寡聚體的形式來壓縮DNA仍存有爭論，需進一步的實驗驗證。值得一提的是，黏連蛋白以二聚體來介導對稱的DNA環(huán)的形成更能與模擬模型相符合[64,68]。

3 黏連蛋白三維結(jié)構(gòu)奧秘

黏連蛋白的SMC1和SMC3亞基為ATP酶，由N末端和C末端形成的head結(jié)構(gòu)域（HD）、中間的hinge結(jié)構(gòu)域以及連接二者的長卷曲螺旋（coiled coil）區(qū)域組成。hinge結(jié)構(gòu)域介導SMC1和SMC3形成異源二聚體[69-70]。SMC1的HD和SMC3的HD附近的卷曲螺旋區(qū)域分別識別SCC1的C末端winged helix結(jié)構(gòu)域（WHD）和N末端的螺旋結(jié)構(gòu)域（N-terminal helical domain,NHD），從而形成閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)[70-73]。SCC1還通過中間的無規(guī)卷曲區(qū)域結(jié)合含有HEAT重復(fù)基序的SCC3、SCC2和PDS5[28,70,74-76]。SCC3可以招募多種調(diào)節(jié)蛋白，其中包括shugoshin和CTCF[33,77]。SCC2與PDS5競爭性地結(jié)合SCC1，調(diào)節(jié)黏連蛋白的裝載與解離[78]。

之前的Rotary shadowing以及負染電鏡研究發(fā)現(xiàn)黏連蛋白存在多種構(gòu)象，包括“O”或“V”形環(huán)狀、“I”形棒狀以及卷曲螺旋完全回折的折疊構(gòu)象[79-82]。對細菌SMC蛋白的研究顯示ATP與DNA的結(jié)合會影響SMC復(fù)合物構(gòu)象[83-85]。當沒有ATP存在時，SMC1和SMC3的長卷曲螺旋區(qū)域毗鄰在一起，形成“I”形棒狀結(jié)構(gòu)。ATP結(jié)合誘導SMC蛋白的HD形成同源或異源二聚體，同時使得它們的卷曲螺旋區(qū)域分開，形成“O”形環(huán)狀結(jié)構(gòu)。ATP的結(jié)合使得黏連蛋白環(huán)形結(jié)構(gòu)分成兩個區(qū)室，分別為由SMC1和SMC3組成的SMC區(qū)室以及由SMC1、SMC3和SCC1組成的kleisin/SCC1區(qū)室[86]。DNA在裝載過程中被認為起始位于SMC區(qū)室，而在有絲分裂期，姐妹染色單體被認為處于kleisin/SCC1區(qū)室[86-87]。DNA進入SMC環(huán)亦會打開毗鄰的SMC1和SMC3卷曲螺旋區(qū)域，促進“O”形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成[85]。

近期，筆者研究組利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了DNA裝載狀態(tài)的人類黏連蛋白與裝載蛋白NIPBL復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，揭示了黏連蛋白、裝載蛋白以及DNA三者的相互作用方式[88]（圖2）。整個復(fù)合物尺寸約為200 ? × 150 ?（1?=0.1 nm）。整體上，該復(fù)合物可以分為三層，分別為由SMC1與SMC3的HD和部分卷曲螺旋區(qū)域組成的第一層，由NIPBL保守的HEAT重復(fù)基序結(jié)構(gòu)域組成的第二層，以及由STAG1與SMC1和SMC3的hinge結(jié)構(gòu)域組成的第三層。三個層次之間緊密相互作用。RAD21依次與SMC3、NIPBL、STAG1以及SMC1結(jié)合，將三個層次串聯(lián)在一起。72個堿基對、富含A/T堿基的雙鏈DNA位于整個復(fù)合物的中央，與黏連蛋白四個亞基以及NIPBL直接接觸。RAD21與DNA共同使得整個復(fù)合物處于相對穩(wěn)定的構(gòu)象。

圖2 人類黏連蛋白、NIPBL與DNA復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)圖。（a）復(fù)合物電子密度圖。HD：head結(jié)構(gòu)域；CC：卷曲螺旋。（b）復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)卡通模型

在該結(jié)構(gòu)中，ATP類似物AMP-PNP介導SMC1和SMC3的HD結(jié)合，形成“V”形異源二聚體?！癠”形NIPBL的兩臂廣泛地作用于“V”形SMC1和SMC3異源二聚體的HD和卷曲螺旋，以“背靠背”的方式相互結(jié)合。DNA位于SMC區(qū)室，與SMC1和SMC3的HD相互作用，并處于它們的卷曲螺旋之間。DNA還被尚未鑒定的由SMC3和NIPBL組成的區(qū)室圈套住，并且在該處發(fā)生約45°的彎曲。NIPBL與DNA的結(jié)合使得SMC1和SMC3的構(gòu)象發(fā)生大幅度改變。它們直接識別SMC蛋白HD上的參與ATP結(jié)合和催化的關(guān)鍵基序，從而刺激黏連蛋白的ATP酶活性。另外，NIPBL和DNA還與SMC3的乙?；稽c鄰近，因此SMC3的乙酰化會直接影響NIPBL與DNA的結(jié)合，這解釋了為什么SMC3的乙?；瘯魅跛鼈儗︷みB蛋白的激活作用以及黏連蛋白的染色質(zhì)壓縮功能[89-90]。

NIPBL被SMC1與SMC3形成的異源二聚體和STAG1夾在中間。“U”形NIPBL與“U”形STAG1以反平行的方式依靠二者的左臂結(jié)合在一起。RAD21上靠近NHD和WHD的無規(guī)卷曲區(qū)域分別識別NIPBL和STAG1的“U”形中間凹槽。DNA橫跨NIPBL兩臂，并伸向STAG1。與單獨的SCC3與DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)[91]不同的是，在整個復(fù)合物中，DNA與STAG1的結(jié)合不是非常緊密，暗示著STAG1/SCC3在復(fù)合物形成之后，DNA的具體識別方式發(fā)生改變。

SMC1與SMC3 的hinge結(jié)構(gòu)域?qū)忝萌旧w黏連以及基因組折疊都有重要貢獻[67]。在該復(fù)合物所處的構(gòu)象中，SMC蛋白的hinge結(jié)構(gòu)域異源二聚體與STAG1的“U”形底部直接結(jié)合，并接觸NIPBL的HEAT重復(fù)基序結(jié)構(gòu)域N末端區(qū)域。由于構(gòu)象柔性，SMC1和SMC3上的大部分卷曲螺旋不可見。然而，為了處于該種特定構(gòu)象，它們需要在中間區(qū)域發(fā)生大角度的彎曲，類似于之前所觀察到的“折疊”構(gòu)象[82]。SMC蛋白的hinge結(jié)構(gòu)域異源二聚體可以結(jié)合單鏈和雙鏈DNA[92]，并被認為是DNA進入黏連蛋白環(huán)的入口[93]。單獨的SMC蛋白hinge結(jié)構(gòu)域二聚體形成贗對稱的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[69]，該二聚體具有兩個界面。在DNA存在的情況下，hinge結(jié)構(gòu)域二聚體的兩個界面可以分別處于開放狀態(tài)。晶體結(jié)構(gòu)顯示單鏈DNA可以結(jié)合在hinge結(jié)構(gòu)域二聚體的表面，并與STAG1結(jié)合區(qū)域部分重疊，暗示兩個相互作用之間互斥。

4 黏連蛋白折疊DNA機制模型

黏連蛋白與NIPBL以及DNA復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)向人們展現(xiàn)了DNA裝載狀態(tài)的黏連蛋白復(fù)合物活性構(gòu)象，解釋了眾多已觀察到但未能被詳細理解的實驗現(xiàn)象?？茖W家根據(jù)已有的實驗證據(jù)提出了各種黏連蛋白折疊DNA的機制模型（詳見Hassler、van Ruite以及Yatskevich等人綜述論文[2,94-95]）。單分子成像顯示黏連蛋白伴隨著DNA環(huán)的延伸而隨之遷移[63-64]，說明黏連蛋白在DNA折疊中沒有固定的DNA結(jié)合位點。電鏡結(jié)構(gòu)顯示黏連蛋白與NIPBL復(fù)合物處于折疊構(gòu)象，并具有多個DNA結(jié)合位點[88]。但是SMC蛋白的hinge結(jié)構(gòu)域并未參與DNA的直接結(jié)合，這與之前的所有機制模型不相符合。依據(jù)三維結(jié)構(gòu)以及單分子成像結(jié)果，筆者提出另一種“尺蠖（inchworm）”模型來解釋黏連蛋白在DNA上的移動機制。在該模型中，SMC1與SMC3的HD、STAG1以及NIPBL為DNA的結(jié)合位點。其中SMC蛋白的HD只有在ATP存在的時候才可以固定住DNA，因此ATP的結(jié)合和水解可以調(diào)節(jié)DNA的結(jié)合和解離并引起黏連蛋白的構(gòu)象變化。ATP的水解引發(fā)黏連蛋白形成棒狀結(jié)構(gòu)，使得STAG1與SMC的HD（和NIPBL）分開，從而驅(qū)動黏連蛋白在DNA上向前移動。ATP的再次結(jié)合誘導折疊構(gòu)象的形成，STAG1與SMC、NIPBL可以再次結(jié)合在一起，實現(xiàn)黏連蛋白在DNA上的移動。如此ATP結(jié)合與水解循環(huán)促進黏連蛋白在DNA上的持續(xù)移動。當黏連蛋白形成二聚體時，兩個復(fù)合物可以相互作為錨定點，介導對稱的DNA環(huán)的形成。這一機制仍需后續(xù)的實驗證據(jù)支持。

5 展望

黏連蛋白對于基因組穩(wěn)定性起著不可或缺的作用，但對于黏連蛋白的研究仍存在許多問題和挑戰(zhàn)。黏連蛋白的三維結(jié)構(gòu)處于動態(tài)變化的過程，并與ATP、DNA以及各種調(diào)控因子的結(jié)合與解離相關(guān)。目前，我們?nèi)圆磺宄诮閷Ы忝萌旧w黏連以及基因組壓縮中，黏連蛋白分別如何與調(diào)節(jié)蛋白以及DNA互作，并發(fā)生何種相應(yīng)的構(gòu)象改變。雖然我們對黏連蛋白裝載DNA時的構(gòu)象有了初步了解，然而對于DNA如何進入黏連蛋白環(huán)，以及WAPL和PDS5如何介導黏連蛋白解離的分子機制仍不清楚。WAPL和PDS5一方面促進黏連蛋白從染色體上解離下來，另一方面對于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域邊界的維持以及會聚規(guī)則具有一定的貢獻[52,96]。這二者之間是如何協(xié)調(diào)的？作為結(jié)合染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域邊界元素的重要因子，CTCF是如何行使該功能的？黏連蛋白與CTCF可以調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄，這又是如何發(fā)生的？更重要的是，黏連蛋白亞基以及NIPBL的突變與多種癌癥以及遺傳性疾病包括德朗熱綜合征的發(fā)生相關(guān)[42,97-99]，這又是怎樣引起的？這些問題的解答將加深理解黏連蛋白的功能機制以及相關(guān)疾病的發(fā)生機理，并有助于尋找新的疾病診治策略。