超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析氟啶胺在冬瓜上的殘留行為

靖俊杰, 賈春虹, 趙爾成, 余蘋中,賀 敏, 陳 莉, 王 東

(北京市農(nóng)林科學院 植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097)

冬瓜Benincasa hispida，又稱白瓜、枕瓜、廣瓜，原產(chǎn)于我國南方和印度，屬葫蘆科冬瓜屬一年生草本植物，富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有降血糖血壓、護腎、美容等藥用功效，被消費者奉為物美價廉、食藥兼用的蔬菜佳品[1-2]。氟啶胺 (fluazinam) 是1988 年由日本石原株式會社中央研究所開發(fā)的二硝基苯胺類廣譜殺菌劑 (結構式見圖式1)，是一種線粒體氧化磷酰化解偶聯(lián)劑，能夠抑制孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子形成[3]，對多種病菌有控制作用，不僅可用于防治草莓灰霉病[4]、花生土傳真菌病害[5]、茉莉白絹病[6]及辣椒[7]、人參[8]及蔥[9]等作物上的病害，同時還可防治柑橘紅蜘蛛[10]等蟲害。

農(nóng)藥殘留聯(lián)合專家會議 (JMPR) 在2018 年的報告中將植物源中氟啶胺殘留定義為氟啶胺[11]，其檢測方法有液相色譜 (LC)[12]、大氣壓電離源氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (APCI-GC-MS/MS)[13]及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS)[14]等。關于氟啶胺在冬瓜上的最大殘留限量 (MRL) 值美國規(guī)定為0.07 mg/kg，歐盟規(guī)定為0.01 mg/kg；國際食品法典委員會 (CAC)、韓國、澳大利亞及日本尚未規(guī)定氟啶胺在冬瓜上的MRL 值；在中國，氟啶胺雖已在大白菜、馬鈴薯、黃瓜和蘋果等作物上登記，但尚未制定其MRL 值[15]。同時，氟啶胺在冬瓜上的殘留行為也未見報道。基于以上調(diào)研數(shù)據(jù)，本研究進行了氟啶胺在冬瓜上的殘留分析方法研究，并開展了500 g/L 氟啶胺懸浮劑在冬瓜上的消解和最終殘留試驗，旨在為該藥劑在冬瓜上的使用提供合理建議，為制定氟啶胺在冬瓜上的殘留限量標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (UPLCMS/MS)：Waters ACQUITY 超高效液相色譜系統(tǒng)和Waters XEVO TQD 三重四極桿質(zhì)譜儀 (美國Waters 公司)；UMV-2 多管漩渦混合器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TDZ5-WS 臺式低速離心機和H1650-W 臺式高速離心機，湖南湘儀儀器實驗開發(fā)有限公司；FOSS Homogenizer 2094 型均質(zhì)機，福斯公司；AG245 電子天平 (1/10 000)，METTLER TOLEDO 公司；Filter Unit 濾膜 (0.22 μm)，美國Waters 公司。

99.6%氟啶胺 (fluazinam) 標準品，馬克西姆公司；500 g/L 氟啶胺懸浮劑 (500 g/L fluazinam SC)，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社。色譜純乙腈，Sigma-Aldrich 公司；甲酸，百靈威公司；分析純氯化鈉，北京化工廠；凈化劑管 (含150 mg 無水硫酸鎂、50 mg N-丙基乙二胺 (PSA))，天津博納艾杰爾科技有限公司。試驗用水均為超純水。

1.2 試驗材料

供試冬瓜Benincasa hispida 品種：串八 (北京)、一串鈴 (山東)、白皮冬瓜 (安徽)、春早一號(湖南)、綠皮冬瓜 (云南) 和小冬瓜 (廣東)。

1.3 田間試驗

按《農(nóng)藥殘留試驗準則》[16]要求，試驗于2017年在北京市、山東省、安徽省、湖南省、云南省和廣東省6 地進行。供試藥劑為500 g/L 氟啶胺懸浮劑，施藥方式為全株噴霧。試驗包括最終殘留試驗和消解動態(tài)試驗兩部分，設空白對照區(qū)、最終殘留試驗低劑量試驗區(qū)、最終殘留試驗高劑量試驗區(qū)和消解動態(tài)試驗區(qū)。樣本采集、樣品制備、儲存等按照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[17]執(zhí)行。

1.3.1 消解動態(tài)試驗 試驗在北京和安徽進行。于冬瓜果實膨大期，冬瓜長至成熟個體一半大小時開始施藥，施藥劑量為推薦高劑量有效成分375 g/hm2(制劑用量750 mL/ hm2)。分別于施藥后2 h 及 1、3、5、7、10、14、21、30 d 隨機采樣，視冬瓜瓜體大小，每次每小區(qū)采集5～10 個 (不少于2 kg) 生長正常的冬瓜。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m 內(nèi)不采樣。

1.3.2 最終殘留試驗 試驗設低劑量有效成分250 g/hm2(制劑用量495 mL/ hm2) 和高劑量有效成分375 g/hm2(制劑用量750 mL/ hm2) 兩個施藥劑量，每個劑量設2 次施藥和3 次施藥兩個處理，每個處理設3 次重復，施藥間隔期7 d。采樣時間距離最后一次施藥的間隔時間分別為5、7和14 d，隨機采樣，每次每小區(qū)采集4～6 個生長正常的冬瓜。另設清水空白對照，處理間設保護帶。

1.4 實驗室樣品制備與保存

將冬瓜表面上附著的雜質(zhì)與尾絲用干毛刷去除后，用不銹鋼刀十字形縱向切成8 塊，取不相鄰的4 塊切成1 cm 左右的小塊，混勻，四分法縮分留樣1 kg。分別取150 g 樣品兩份，于 ?20 ℃保存，備用。

1.5 檢測方法

1.5.1 樣品前處理 將冬瓜樣品與適量干冰混合，均質(zhì)后稱取10 g 于50 mL 離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋提取3 min；加入3.0 g 氯化鈉，渦旋1 min，于4 000 r/min 下離心5 min；取1.5 mL 上清液轉(zhuǎn)入2 mL 凈化劑管 (含150 mg MgSO4+50 mg PSA) 中，渦旋 1 min 后于 12 000 r/min 下離心3 min；取上清液過0.22 μm 濾膜，待UPLCMS/MS 分析。

1.5.2 檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)；柱溫 40 ℃；流速 0.3 mL/min；進樣量3 μL。流動相A 為乙腈，B 為0.1%甲酸水。梯度洗脫程序：0～3 min，10%A+90%B；＞3 min～4.2 min，90%A+10%B；＞4.2 min～5.2 min，10%A+90%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描方式(ESI+)；毛細管電壓3.2 kV；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣和錐孔反吹氣均為高純氮氣，去溶劑氣溫度400 ℃，去溶劑氣流速700 L/h，錐孔反吹氣流速50 L/h；碰撞氣為高純氬氣。氟啶胺定量離子對464.98＞373.0，錐孔電壓40 V，碰撞能36 V；定性離子對464.98＞337.9，錐孔電壓40 V，碰撞能58 V。

1.5.3 標準溶液配制及標準曲線繪制 稱取氟啶胺標準品0.05 g (精確至0.000 1 g) 于100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并配制成500 mg/L 的標準母液；繼而再用乙腈稀釋配制成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 和 0.5 mg/L 的系列標準溶液，按1.5.2 節(jié)的條件測定。以標準溶液的質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標，定量離子峰面積 (y) 為縱坐標，繪制工作曲線。

1.5.4 添加回收試驗 向空白冬瓜樣品中添加氟啶胺標準溶液，添加水平分別為0.01、0.05、0.1和1 mg/kg，每個水平5 個重復，另設空白對照，按照1.5.1 節(jié)前處理方法進行樣品前處理，按1.5.2節(jié)條件測定，計算添加回收率及相對標準偏差 (RSD)。

2 結果與分析

2.1 方法的準確度和精密度

以氟啶胺標準溶液的質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標，峰面積 (y) 為縱坐標繪制標準曲線，得到氟啶胺線性方程為y = 49 425x + 254.4，相關系數(shù)r = 0.998，表明在0.002～0.5 mg/L 范圍內(nèi)，氟啶胺的質(zhì)量濃度與其峰面積間呈現(xiàn)良好的線性關系。

在0.01～1 mg/kg 添加水平下，氟啶胺在冬瓜中的平均回收率在 8 9%～1 0 9% 之間，R S D在2.8%～12%之間，符合農(nóng)藥殘留檢測[18]的要求。典型色譜圖見圖1。

2.2 氟啶胺在冬瓜上的消解規(guī)律

消解動態(tài)試驗結果 (表1) 表明，氟啶胺在冬瓜上的消解規(guī)律符合一級反應動力學模型。其中安徽試驗點，藥后1 和3 d 的殘留量數(shù)據(jù)異常，可能原因是采樣過程出現(xiàn)問題，因此未計算在內(nèi)。從結果看，雖然北京試驗點氟啶胺的原始沉積量低于安徽，但兩地氟啶胺在冬瓜上的消解半衰期基本一致。

表1 氟啶胺在冬瓜中的消解動態(tài) (n = 3，2017 年)Table 1 Dissipation of fluazinam in wax gourd (n = 3，2017)

2.3 氟啶胺在冬瓜上的最終殘留量

最終殘留試驗結果 (表2) 表明，氟啶胺在冬瓜上的最終殘留量隨著采收間隔期的延長而降低，隨著施藥劑量的增大而增加。

表2 氟啶胺在冬瓜中的最終殘留量 (n = 3, 2017 年)Table 2 Terminal residue of fluazinam in wax gourd (n = 3, 2017)

3 結論與討論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定冬瓜中氟啶胺殘留的分析方法，平均回收率和相對標準偏差均符合《農(nóng)作物農(nóng)藥殘留試驗準則》[18]的要求。

2017 年在北京和安徽兩試驗點進行的消解動態(tài)試驗結果顯示，500 g/L 氟啶胺懸浮劑按照推薦高劑量有效成分375 g/hm2施藥1 次后，氟啶胺在冬瓜上的消解規(guī)律符合一級反應動力學模型，消解半衰期為2.04～2.17 d；在北京市、山東省、安徽省、湖南省、云南省和廣東省6 地進行的最終殘留試驗數(shù)據(jù)顯示，500 g/L 氟啶胺懸浮劑兩個施藥劑量 (有效成分低劑量為250 g/hm2，高劑量為375 g/hm2)、兩種施藥次數(shù) (2 次和 3 次) 以及 3 個采收間隔期 (5、7 和14 d) 的冬瓜樣品中氟啶胺檢出率不超過15%，殘留量最大值 (HR) 為0.048 mg/kg。農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量受施藥次數(shù)、施藥劑量和采收間隔期等因素影響，本研究中氟啶胺的最終殘留結果并未嚴格遵守上述規(guī)律，可能原因是不同試驗地點田間樣本大小、采樣均勻程度、冬瓜品種、氣候條件、成熟程度有一定差異，導致氟啶胺在冬瓜上的最終殘留量有所不同。

綜上所述，為達到防治冬瓜霜霉病同時降低農(nóng)藥殘留的目的，推薦500 g/L 氟啶胺懸浮劑用于防治冬瓜霜霉病時按有效成分250 g/hm2(制劑用量495 mL/ hm2) 施藥3 次，距末次施藥的采收間隔為7 d。