固定化酵母細胞原生質(zhì)體的制備

何占魁

【教學(xué)目標】

1.應(yīng)用“酵母細胞的固定化”實驗中獲得的技能在新的情境中解決問題;

2.發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力。

【教學(xué)重點】

1.嘗試設(shè)計科學(xué)可行的實驗方案;

2.原生質(zhì)體的制備、分離的原理和方法。

【教學(xué)難點】

原生質(zhì)體的制備和分離。

【教學(xué)準備】

1.材料用具：袋裝干酵母、蝸牛酶（或β-葡聚糖酶）、葡萄糖、海藻酸鈉、CaCl2、NaCl等;

2.分組：教師將全班56人分成14個小組，對學(xué)生進行合作學(xué)習(xí)技能的培訓(xùn)。

【教學(xué)進程】

一、提供信息——分析資料

1.固定化原生質(zhì)體由于解除了細胞壁的擴散障礙，可增加細胞膜的通透性，有利于細胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，是胞內(nèi)酶等細胞內(nèi)物質(zhì)的優(yōu)化生產(chǎn)技術(shù)。酵母細胞壁的主要成分是β-葡聚糖。

2.β-葡聚糖酶（β- 1，3 - 1，4 葡聚糖酶）：市售β-葡聚糖酶為淡黃色粉末或棕色液體，專一作用于β-葡聚糖的 1，3 及 1，4 糖苷鍵，產(chǎn)生 3～5 個葡萄糖單位的低聚糖及葡萄糖;適用溫度范圍為30～60℃ ，最適溫度范圍為50～55℃;適用PH范圍4.8～7.5 ，最適 PH 范圍 6.0～6.5。

3.蝸牛酶：從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，含纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶，酵母細胞經(jīng)巰基化合物處理后， 懸浮于PH5.8-7.2等山梨醇溶液中， 每克細胞經(jīng)30-40mg酶在37℃保溫1小時即可溶解細胞壁， 破壁率90%以上;4℃保存。

4.海藻酸鈉凝膠是從海藻中提取獲得的藻酸鹽，為D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物，多價陽離子如Ca2+可誘導(dǎo)凝膠形成。

5.在原生質(zhì)體制備中，宜選用對數(shù)期的菌體作為材料。

二、小組討論——設(shè)計方案

1.如何獲得酵母細胞的原生質(zhì)體？

2.獲得的原生質(zhì)體如何保存才能保持活性？能直接置于蒸餾水中嗎？

3.如何配制含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液？能否用磷酸鹽配制緩沖液？

4.固定化原生質(zhì)體的制備與固定化細胞的制備相比，操作程序有何不同？

三、表達交流——完善方案

四、實驗操作——實施方案（略）

五、問題探討——活躍思維

1.固定化原生質(zhì)體凝膠珠中能否觀察到出芽生殖現(xiàn)象？

2.原生質(zhì)體失去增殖能力，但仍能進行新陳代謝。請根據(jù)以上特點，設(shè)計實驗檢測酶解后是否得到了原生質(zhì)體？

3.能否通過延長酶解時間來提高原生質(zhì)體的形成率？

六、成果評價

1.一“看”——觀察凝膠珠的顏色和形狀。

2.二“測”——檢測凝膠珠的質(zhì)量是否合格。

3.三“試”——葡萄糖溶液發(fā)酵試驗：利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵。

討論：本實驗可通過哪些手段檢測發(fā)酵結(jié)果？

七、實驗誤差分析及校正

1.制作的凝膠珠成蝌蚪狀。

可能的原因一：海藻酸鈉溶液濃度過高。

解決方案：雖然嚴格按教材配方配制，但加熱過程中有不少水分揮發(fā)使海藻酸鈉溶液濃度升高，所以必須加蒸餾水定容至10ml。

可能的原因二：注射器中的溶液推進速度過快，或針筒口離CaCl2液面距離過近，高度不夠。

解決方案：反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)：注射器針筒口與CaCl2溶液液面的距離在20-30cm左右，凝膠珠容易成圓形;注射器中的溶液要以恒定速度緩慢地滴加。

2.酒精燈加熱溶化海藻酸鈉的過程中出現(xiàn)了焦糊。

可能原因：加熱太快。

解決方案：加熱的火候控制要適宜，應(yīng)小火或間斷加熱。實踐證明：90℃水浴加熱或用高壓蒸汽鍋加熱，能有效地避免焦糊。

3.制作的凝膠珠有部分漂浮在CaCl2溶液表面，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)凝膠珠輕，有氣泡。

可能原因：海藻酸鈉溶液和酵母細胞混合的過程中速度過快，混合不均勻，使溶液中混有空氣。

解決方案：攪拌過程中要勻速、輕柔，如出現(xiàn)氣泡就用玻璃棒攪破，就不會出現(xiàn)漂浮的凝膠珠。

4.將制備良好的凝膠珠和40%的葡萄糖溶液混合后，適宜條件下培養(yǎng)，2天后發(fā)現(xiàn)無酒味。

可能原因：40%的葡萄糖溶液濃度過大，導(dǎo)致酵母細胞失水過多死亡。

解決方案：將制備好的凝膠珠和10%的葡萄糖溶液混合放入恒溫箱培養(yǎng)，2天后出現(xiàn)了酒味。

八、分析與討論

1.如何獲得酵母細胞的原生質(zhì)體？

2.獲得的原生質(zhì)體如何保存才能保持活性？能直接置于蒸餾水中嗎？

3.如何配制含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液？能否用磷酸鹽配制緩沖液？

4.固定化原生質(zhì)體的制備與固定化細胞的制備相比，操作程序有何不同？

【基金項目：江蘇省教育科學(xué)“十三五”規(guī)劃重點資助2018年度課題“高中生物探究性學(xué)習(xí)中培養(yǎng)學(xué)生的關(guān)鍵能力研究”，No.B-a/2018/02/29。泰州市教育科學(xué)“十三五”規(guī)劃2018年度課題“基于探究性學(xué)習(xí)的高中生物校本課程開發(fā)的研究”，2018jksyiblx008】