靈芝破壁孢子粉功效成分提取條件優(yōu)化及去壁全溶高含量孢子粉的制備

劉世柱 吳欣燦 胡麗玲 吳志君 周曉云 王家俊 吳經(jīng)偉

靈芝破壁孢子粉功效成分提取條件優(yōu)化及去壁全溶高含量孢子粉的制備

劉世柱 吳欣燦*胡麗玲 吳志君 周曉云 王家俊 吳經(jīng)偉

（浙江方格藥業(yè)有限公司，浙江 慶元 323800）

以破壁靈芝孢子粉為原材料，通過(guò)提取、分離、濃縮、噴霧干燥制得一種去壁全溶高含量靈芝孢子粉，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究溶劑乙醇添加量、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)多糖和三萜含量的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，結(jié)果為：影響多糖和三萜含量高低的因素依次為溶劑中乙醇添加量＞提取溫度＞提取時(shí)間；綜合分析得到提取最佳工藝組合為溶劑乙醇添加量10%，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間3 h（二次提取）。在此條件下制得的去壁全溶靈芝孢子粉多糖含量達(dá)到7.79%，三萜含量達(dá)到7.76%。

孢子粉；多糖；三萜；含量；提取條件

靈芝是一種大型藥用真菌。性甘味平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)。屬擔(dān)子菌類(lèi)多孔菌科真菌赤芝（Leyss. exFr.）Karst.或紫芝Zhao，Xu et Zhang的干燥子實(shí)體[1]。靈芝生長(zhǎng)成熟后期從菌蓋彈射出來(lái)的極其細(xì)小的顆粒即為靈芝孢子粉，生物學(xué)上稱(chēng)之為擔(dān)孢子，它是靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì)[2]。其主要成分有多糖、三萜、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷等，其中多糖和三萜是主要的活性物質(zhì)，近年來(lái)是人們研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子粉具有免疫調(diào)節(jié)[3-5]、抗氧化[6-8]、抗腫瘤[9-11]、抗衰老[12, 13]、降血糖[14-16]、保肝[17, 18]等作用。

靈芝孢子具有雙壁結(jié)構(gòu)，雙壁由幾丁質(zhì)與纖維素構(gòu)成，質(zhì)地堅(jiān)硬，活性成分被包裹，不易溶出，影響人體吸收[19]。因此，目前絕大多數(shù)的孢子粉產(chǎn)品都經(jīng)不同的破壁工藝粉碎孢子壁[20]，以提高其活性成分在人體內(nèi)的生物利用度。但破碎后的孢子壁仍與有效成分混合在一起，最終產(chǎn)品的多糖和三萜含量未得到提高。目前市面上出售的破壁靈芝孢子粉，平均多糖含量約1.54%，三萜含量約4.22%[21]。孢子粉壁的存在影響飲用口感，一些消化功能不全者在大量飲用后，易造成消化不良。

本研究以破壁靈芝孢子粉為原材料，通過(guò)提取、分離、濃縮、噴霧干燥，制成一種去壁全溶高含量靈芝孢子粉。在這個(gè)過(guò)程中，探究反應(yīng)溶劑、提取溫度、提取時(shí)間這3個(gè)主要因素對(duì)孢子粉多糖和三萜含量的影響，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取條件，為孢子粉的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為促進(jìn)產(chǎn)業(yè)鏈升級(jí)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

破壁靈芝孢子粉來(lái)源于浙江方格藥業(yè)有限公司。試劑有D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品；高氯酸、冰乙酸、香草醛、乙酸乙酯、甲醇、無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸，均為分析純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器

萬(wàn)分之一電子分析天平，HH-4a磁力攪拌恒溫水浴鍋，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，DL-6000B飛鴿牌系列離心機(jī)，UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，ZSG·G650電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，噴霧干燥機(jī)。

1.3 方法

（1）實(shí)驗(yàn)步驟。精密稱(chēng)取一定量的破壁靈芝孢子粉于圓底燒瓶中，放入磁石，加入20倍預(yù)先配制好的溶劑。溶劑選用乙醇與超純水按一定比例配置，在一定溫度下攪拌提取一定時(shí)間，離心機(jī)設(shè)置參數(shù)（3 000 r/min、10 min）離心分離上清液及沉渣，取沉渣再次加入20倍預(yù)先配制好的溶劑進(jìn)行二次提取，離心機(jī)設(shè)置參數(shù)（3 000 r/min、10 min）離心分離上清液及沉渣，棄去沉渣，合并2次上清液。取上清液濃縮處理，噴霧干燥即得。

（2）多糖含量測(cè)定。精密稱(chēng)取D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.0000 g，加水溶解后以水稀釋至1 000 mL，此溶液1 mL含1 mg葡萄糖，用前稀釋10倍（0.1 mg/mL），現(xiàn)用現(xiàn)配。精密量取對(duì)照品溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別置于具塞試管中，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，再加苯酚溶液1.00 mL，搖勻，依次加入濃硫酸5.00 mL，搖勻，置沸水浴2 min，取出置室溫下，于波長(zhǎng)485 nm處，以空白試劑為參比測(cè)定吸收度。以含糖量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱(chēng)取樣品2.0 g，置圓底燒瓶中，精密加水100 mL，稱(chēng)定重量，分散均勻后加熱回流3 h，放冷，再稱(chēng)定重量，加水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置數(shù)小時(shí)，準(zhǔn)確吸取上清液5.00 mL，加入無(wú)水乙醇25 mL，搖勻，4 ℃靜置過(guò)夜。以4 000 r/min離心15 min，棄去上清液。沉淀用水溶解定容至25.0 mL，混勻后，吸取供試品溶液1.00 mL，加水補(bǔ)充至2.00 mL，再加苯酚溶液1.00 mL，搖勻，依次加入濃硫酸5.00 mL，搖勻，置沸水浴2 min，取出置室溫下，于485 nm處，以試劑空白為參比測(cè)定吸光度。

式中：m1為測(cè)定用樣品溶液中相當(dāng)葡萄糖的量（mg）；m為樣品質(zhì)量（g）；1為樣品提取液總體積（mL）；2為沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；3為樣品測(cè)定液總體積（mL）；4為測(cè)定用樣品溶液體積（mL）。

（3）三萜含量測(cè)定。精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，超聲15 min，并稀釋至刻度，搖勻，制成0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL和1.20 mL，于100 ℃水浴蒸干后放置室溫下，加入0.40 mL 15%香草醛-冰乙酸和1.00 mL高氯酸，在65 ℃水浴加熱15 min并移入冰水浴中3 min，取出放置室溫下，再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻并置于室溫。15 min后用分光光度計(jì)于550±2 nm波長(zhǎng)下測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光度。分別以濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱(chēng)取樣品1.0 g，置于100 mL容量瓶中，用約85 mL乙酸乙酯溶解，超聲30 min，過(guò)濾，用少量乙酸乙酯淋洗濾渣，定容至刻度，搖勻。吸取1 mL該溶液，于100 ℃水浴蒸干后放置室溫下，加入0.40 mL香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，65 ℃水浴加熱15 min并移入冰水浴中3 min，取出放置室溫下，再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻并置于室溫下。15 min后用分光光度計(jì)于552±2 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品液的吸光度。靈芝三帖含量計(jì)算公式：

（4）單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)去壁全溶高含量孢子粉的制備工藝，以靈芝多糖和靈芝三萜含量作為參考指標(biāo)，分別考察5個(gè)溶劑中95%乙醇添加量（0%、5%、10%、15%、20%）、4個(gè)提取溫度（70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）和4個(gè)提取時(shí)間（1.5 h、2 h、2.5 h、3 h）的影響。

（5）正交試驗(yàn)。選取3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)中的最佳實(shí)驗(yàn)條件，采用L9(33)正交設(shè)計(jì)對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）反應(yīng)溶劑對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，以破壁靈芝孢子粉為原料，在提取溫度為100 ℃，提取時(shí)間為2 h，液料比為1︰20的條件下，隨乙醇添加量增加，多糖含量呈下降趨勢(shì)，三萜含量呈上升趨勢(shì)。溶劑乙醇添加量在0%時(shí)，多糖含量最高，但幾乎不存在三萜；添加量超過(guò)20%時(shí)，由于乙醇含量高，沸點(diǎn)只有78.3 ℃，加熱提取過(guò)程導(dǎo)致加熱回流裝置中的溶劑爆沸，沿冷凝管沖出，不適用于實(shí)際生產(chǎn)。

圖1 反應(yīng)溶劑中95%乙醇不同添加量下靈芝多糖和靈芝三萜的含量

綜合考慮，溶劑中乙醇添加量以10%為最佳，其多糖和三萜含量分別為7.68%和7.67%。因此，正交試驗(yàn)選取溶劑乙醇添加量范圍宜為5%～15%。

（2）提取溫度對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，以破壁靈芝孢子粉為原料，在溶劑乙醇添加量為10%，提取時(shí)間為2 h，料液比為1︰20的條件下，隨提取溫度提高，多糖和三萜含量呈上升趨勢(shì)。提取溫度為70 ℃時(shí)，多糖和三萜含量最低，分別為5.85%和6.33%；溫度為100 ℃時(shí)，多糖和三萜含量最高，分別為7.65%和7.70%。因此，正交試驗(yàn)選取提取溫度范圍宜為80～100 ℃。

圖2 不同提取溫度的靈芝多糖和靈芝三萜含量

（3）提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，以破壁靈芝孢子粉為原料，在溶劑乙醇添加量為10%，提取溫度為100 ℃，液料比為1︰20的條件下，隨提取時(shí)間增加，多糖和三萜含量呈上升趨勢(shì)。提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，多糖和三萜含量最低，分別為7.36%和7.14%；提取時(shí)間為3 h時(shí)，多糖和三萜含量最高，分別為7.71%和7.74%。因此，正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間范圍宜為2～3 h。

圖3 不同提取時(shí)間的靈芝多糖和靈芝三萜含量

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)表1、表2和表3極差分析結(jié)果可知，影響多糖和三萜含量高低的因素依次為乙醇添加量A＞提取溫度B＞提取時(shí)間C，通過(guò)直觀分析初步得到多糖的較佳提取工藝方案為A2B3C2，三萜的較佳提取工藝方案為A2B3C3。

表1 正交試驗(yàn)參數(shù)表L9(33)

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 多糖和三萜極差分析結(jié)果

根據(jù)方差分析結(jié)果（表4、表5）可知，A（溶劑中乙醇添加量）對(duì)多糖和三萜含量的影響均極顯著；B（提取溫度）對(duì)三萜含量的影響不顯著，而對(duì)多糖含量的影響顯著；C（提取時(shí)間）對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜含量的影響均不顯著。故綜合得出多糖和三萜提取最佳工藝方案為A2B3C3。

對(duì)所得的最佳工藝條件進(jìn)行5次平行試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，采用該工藝制備的靈芝孢子粉多糖和三萜的含量均高于正交試驗(yàn)中的其他結(jié)果，驗(yàn)證此最佳方案可行。此方案制備得到的去壁全溶高含量孢子粉，多糖和三萜的含量分別達(dá)到7.79%±0.05%和7.76%±0.04%，其提取的最佳工藝為溶劑中添加95%乙醇量為10%、提取溫度為100 ℃、提取時(shí)間為3 h（二次提取）。

表4 多糖含量方差分析結(jié)果

注：**表示＜0.01，差異極顯著；*表示0.01＜＜0.05，差異顯著，下同。

表5 三萜含量方差分析結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究以破壁靈芝孢子粉為原材料，通過(guò)提取、分離、濃縮、噴霧干燥制得一種去壁全溶高含量靈芝孢子粉，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究溶劑乙醇添加量、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)多糖和三萜含量的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，得到最佳工藝組合即溶劑添加95%乙醇量為10%，提取溫度為100 ℃，提取時(shí)間為3 h（二次提?。?，在此條件下制得的靈芝孢子粉多糖含量達(dá)到7.79%，三萜含量達(dá)到7.76%。該工藝操作簡(jiǎn)便，成本低廉，可為靈芝孢子粉的工業(yè)化生產(chǎn)、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)鏈升級(jí)提供參考。

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劉世柱（1982－），男，碩士，主要從事食用菌功能性成分提取技術(shù)研究，E-mail：478079599@qq.com。

吳欣燦（1996－），男，學(xué)士，主要從事功能食品研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：347495283@qq.com。

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